de nombreuses applications biologiques telles que la microbiologie, la culture cellulaire, le travail sanguin et bien d’autres qui utilisent des cellules nécessitent que nous déterminions la concentration cellulaire pour notre expérience.

le comptage cellulaire est assez simple et nécessite une chambre de comptage appelée hémocytomètre, un dispositif inventé par L’anatomiste français Louis-Charles Malassez au 19ème siècle pour effectuer la numération des cellules sanguines. Un hémocytomètre se compose d’une lame de microscope en verre épais avec une grille de lignes perpendiculaires gravées au milieu., La grille a des dimensions spécifiées de sorte que la zone couverte par les lignes est connue, ce qui permet de compter le nombre de cellules dans un volume spécifique de solution.

la Figure 1. Un hémocytomètre classique

le type d’hémocytomètre le plus courant a une forme en « H” gravée au milieu qui entoure deux surfaces de grille polies en forme de miroir séparées et fournit la zone de montage du couvercle (Figure 1).,

chargement de l’hémocytomètre

avant de commencer assurez-vous que l’hémocytomètre et sa lamelle sont propres en enlevant les particules de poussière avec du papier pour lentilles. Les Coverslips utilisés pour le montage sur des hémocytomètres sont spécialement conçus pour être plus épais que les coverslips de microscopie classiques, car ils doivent pouvoir surmonter la tension superficielle d’une goutte de liquide.

assurez-vous de placer d’abord la lamelle sur la surface de comptage avant de charger la suspension cellulaire., Ensuite, placez la pointe de la pipette avec votre échantillon dans l’un des puits en forme de V, comme sur la Figure 2, et expulsez doucement l’échantillon. La zone sous la lamelle se remplit par capillarité. Suffisamment de liquide doit être introduit pour que la surface en miroir soit juste recouverte, généralement autour de 10 µl, mais ne pas trop remplir la surface. Vous pouvez charger deux échantillons sur un hémocytomètre, un dans chacune des deux grilles.

la Figure 2., Chargement de L’hémocytomètre

l’hémocytomètre chargé est ensuite placé sur l’étage du microscope et la grille de comptage est mise au point à faible puissance. Laissez l’échantillon se déposer pendant quelques minutes et évitez de déplacer la lamelle car elle pourrait introduire des bulles d’air et rendre le comptage difficile.

comptage des cellules dans un hémocytomètre

la grille complète d’un hémocytomètre contient neuf carrés de 1 mm2 chacun (Figure 3). La zone de comptage centrale de l’hémocytomètre (Figure 3B) contient 25 grands carrés et chaque grand carré a 16 petits carrés., Lors du comptage, comptez uniquement les cellules sur les lignes des deux côtés du grand carré pour éviter de compter les cellules deux fois (Figure 3G). Les Suspensions doivent être suffisamment diluées pour que les cellules ou autres particules ne se chevauchent pas sur la grille et soient réparties uniformément.

la Figure 3. Comptage des cellules sur L’hémocytomètre.

pour distinguer les cellules mortes des cellules viables, l’échantillon est souvent dilué avec une tache particulière, comme le bleu de Trypan., Cette méthode de coloration, également connue sous le nom de coloration d’exclusion de colorant, utilise un colorant diazo qui pénètre sélectivement dans les membranes cellulaires des cellules mortes, les colorant en bleu, alors qu’il n’est pas absorbé par les membranes des cellules vivantes, excluant ainsi les cellules vivantes de la coloration. Lorsqu’elles sont vues au microscope, les cellules mortes apparaissent en bleu foncé (Figure 4)

Figure 4. Trypan Bleu Exclusion des cellules vivantes sur L’hémocytomètre. (La flèche indique l’absorption de colorant à travers la membrane des cellules mortes.,)

pour effectuer le comptage, déterminez le grossissement nécessaire pour reconnaître le type de cellule souhaité et comptez systématiquement les cellules dans des carrés sélectionnés afin que le nombre total soit d’environ 100 cellules, un nombre minimum de cellules nécessaire pour un comptage statistiquement significatif.

pour les grandes cellules, vous pouvez simplement compter les cellules à l’intérieur des quatre grands carrés d’angle (Figure 3C-F) et du milieu (Figure 3B). Pour une suspension dense de petites cellules, vous pouvez compter les cellules dans les quatre carrés extérieurs et moyens du carré central (Figure 3B) ou faire une suspension plus diluée.,

rappelez-vous si une cellule chevauche une décision, comptez-la comme « in” si elle chevauche la décision en haut ou à droite, et « out” si elle chevauche la décision en bas ou à gauche (Figure 3G).

l’aire du milieu (Figure 3B) et de chaque carré d’angle (Figure 3C-F) est de 1 mm x 1 mm = 1 mm2: la profondeur de chaque carré est de 0,1 mm. le volume final de chaque carré à cette profondeur est de 100nl.,

Une fois que vous avez obtenu le nombre total de cellules, la concentration cellulaire peut être calculée à partir de la formule suivante:

ainsi, par exemple, si vous avez dilué votre échantillon 1:1 avec du bleu Trypan, et que vous avez compté 325 cellules dans 4 carrés d’angle plus le grand carré central, e3b137b489″>