přesná replikace genomu je kritická pro životaschopnost jakéhokoli organismu. Obecný pojem pro kopírování DNA byl patrný na objasnění DNA dvojité spirálové struktury a identifikace základní pár doplňkovost (1): jeden pramen nukleobází by mohl sloužit jako šablona pro syntézu nového vlákna. Během deseti let od těchto objevů byl agent vyčištěn z E. coli, který katalyzoval duplikaci dna (2). Toto činidlo bylo nazýváno „polymerázou“. E., coli DNA Polymerázy I, první DNA polymerázy objevena nebyla primární replikační polymerázy, ale místo toho se podílejí zaostávající strand Okazaki fragment usnesení a opravy DNA. To předznamenalo budoucí objevy mnoha rodin DNA polymerázy, z nichž každá slouží specifickým buněčným požadavkům na replikaci a opravu DNA.

DNA polymerázy slouží jako základní enzymy ve vědách o životě ze stejného důvodu, že mají kritickou povahu: kopírují DNA. Polymerázové aplikace zahrnují označování DNA, sekvenování a amplifikaci., Jeden specifický amplifikační protokol, polymerázová řetězová reakce (PCR) je široce používaná technika, která zaměstnává termofilní polymerázy exponenciální amplifikaci specifických segmentů DNA (3) a umožňuje řadu aplikací z lidských a patogenních diagnostika na molekulární klonování v biologických laboratořích po celém světě.

Polymerázová Přesnost

PCR klade stejné základní požadavky na polymerázové jako buňka staví na jeho replikace systému. V podstatě by polymeráza měla být spolehlivá, přesná a rychlá., Polymerázová přesnost nebo „věrnost“ se týká sklonu začlenit správný nukleotid, jak je uvedeno v řetězci šablony. Standardní PCR enzymy jsou, není divu, docela přesné. I Thermus aquaticus (Taq) DNA polymeráza, za nízké fidelity PCR polymerázová, jen dělá chybu v přibližně nukleotidů inzerce (12)., Objev polymerázové a inženýrské úsilí vyrábí high fidelity polymerázy, které jen zřídka se základní substituční chyby, které vyžadují sekvenování DNA metody číst miliony syntetizován základen pro detekci jakékoliv chyby na polymerázové Pokroky v měření fidelity o single-molecule sekvenování určila Q5® High-Fidelity DNA Polymerase jako s věrností 280X větší thanTaq DNA polymerázy (12).,

Věrnostní body: geometrický výběr na aktivní místo a za

DNA polymerázy zajistit přesné replikace pomocí řady molekulární kontrolní stanoviště, v místě zabudování nukleotidů a mimo něj (1). Během přidávání nukleotidů je správný příchozí nukleotid umístěn pro produktivní vyrovnání katalytických skupin, což zajišťuje efektivní začlenění. Toto vyrovnání za katalýzy je citlivý k narušení polohy způsobené nesprávným Watson-Crick párování bází umožňuje kinetické zdržování při nesprávné nebo non-příbuzný párů bází.,

korektura DNA polymeráz

další metodou zvyšování věrnosti je, aby polymeráza měla aktivitu 3→5 exonukleázy, nazývanou „korektura“. Pomocí výše popsaných molekulárních kontrolních bodů na bázi a aktivním místě je Taq DNA polymeráza neuvěřitelně přesná, ale korekturní enzymy mohou mít ještě vyšší věrnost. Tato dodatečná přesnost je zprostředkována korekturou, přičemž polymeráza „kontroluje“, zda byl do šablony vložen správný nukleotid., Pokud je zjištěn nesoulad, je DNA přenesena z polymerizační domény do n-terminálu 3→5 exonukleázové domény polymerázy. Nesprávně začleněný nukleotid je vyříznut, DNA se přesune zpět do polymerační domény a kopírování může pokračovat (Obrázek 2).

Bakteriofága T4 se ukázalo být užitečné experimentální systém pro hodnocení důležitosti 3→5 exonuclease aktivity pro přesné replikace DNA (6). Byly identifikovány mutace v genu T4 43 (který kóduje DNA polymerázu), které buď snížily nebo zvýšily věrnost. Definováním poměru aktivity exonukleázy/polymerázy (N/P) pro mutantní enzym bylo zjištěno, že polymerázy s nízkými poměry N/P byly náchylnější k chybám než ty s vysokými poměry N/P., Vysvětlení pro tato pozorování je, že po vložení neodpovídající bázi, je více pravděpodobné, že exonuclease odstraní nukleotidů před polymerázová aktivita rozšiřuje na enzymy s vyšší N/P poměr. Zajímavé je, že účinnost korektury polymerázy může vykazovat sekvenční závislost. Například sekvence bohaté na AT jsou účinněji korekturovány než regiony GC. Předpokládá se, že tento nesoulad je způsoben nižší stabilitou v oblastech, které usnadňují tavení pramenů, a tím i korekturou.,

absence aktivity exonukleázy 3→5 může mít jiné důsledky než věrnost v PCR. Bylo navrženo, že nedostatek korekturační aktivity v Taq DNA Polymeráze omezí možnou velikost amplikonu tímto enzymem (7). Obecně platí, že Taq funguje nejlépe při zesílení fragmentů DNA < 2 kb a může pracovat s fragmenty až do 3-4 kb. Při zachování této velikosti ampliconu je Taq robustním, snadno optimalizovaným enzymem. Nad ~3 kb však rychle klesá účinnost., Během PCR, Taq se misincorporate nukleotidy a vytvářet nesoulad, na který je náchylný k přetažení a je více pravděpodobné, že k separaci před prodloužením ve srovnání se správně spárované základny 3 končí. Proto se při určité velikosti amplikonu a chybové rychlosti polymerázy může hromadit dostatek neshodných 3 konců, aby se účinně inhiboval proces PCR. Tyto neshodné 3 konce jsou pro Taq obzvláště problematické, protože k jejich odstranění postrádá aktivitu exonukleázy 3→5., Přidáním malého množství korektorového enzymu, jako je Deep vent ® DNA polymeráza, lze dosáhnout amplifikace fragmentů ≥ 20 kb (obrázek 3). Protože drtivá většina enzymu ve směsi je Taq DNA Polymeráza je to pravděpodobně dělat většinu primer extension, s korektury Deep Vent polymeráza odstranění inhibiční 3 nesouladu generované Taq.,

Polymerázová Processivity

význam korektury činnost PCR byl široce známý pro téměř dvě desetiletí, ale další vlastnost, processivity, získala zvýšenou pozornost., „Procesivita“ je termín, který odkazuje na počet nukleotidů začleněných polymerázou do jediné vazebné události (před disociací). Taq DNA polymeráza přidává přibližně 50 nukleotidů na vazebnou událost (8). Proč na tom záleží? Nízkoprocesivita nebo“ distributivní “ polymeráza rozšiřuje populaci šablon výrazně odlišným způsobem než procesivní polymeráza. Vysoce distributivní polymeráza se váže na šablonu, přidává několik nukleotidů a disociuje, takže populace šablon, které lze s časem rozšířit stejně., Vysoce procesivní polymeráza váže šablonu a prodlužuje se s delšími vazebnými událostmi.

následovalo by, že vzhledem k dostatečnému času by výsledek buď procesivní nebo distribuční polymerázové reakce byl populací kopírovaných šablon. Za určitých okolností je však možné, že procesivní polymeráza má vynikající výkon. E. coli polymeráza III α podjednotky, která je součástí hlavní replikační polymerázu, má processivity < 10 párů bází a rychlosti < 20 nukleotidů za sekundu (nt/s)., Nicméně, když podjednotky společníci s ostatními replisome podjednotek, zejména posuvné svorky, efektivní processivity a replikace rychlost zvýší na > 50 kb a 1000 nt/s, respektive (9). Termín „efektivní procesivita“ se používá, protože existují údaje, které naznačují, že polymerázová podjednotka se může v replisomu vyměnit, ale replisom udržuje rychlou, procesivní replikaci DNA (10).

aby vědci využili procesivity v PCR, spojili doménu vázající DNA s archaeální polymerázou (11)., Tento chimérický enzym má několik vylepšených vlastností, ale především je schopen pro amplifikaci DNA s kratší prodloužení časů a vyrábět déle DNA produkty efektivněji, a tím zkrácení celkové thermocycling krát. Tato myšlenka fúze je základem Q5 High-Fidelity DNA polymerázy a Phusion® High-Fidelity DNA polymerázy, dvou polymeráz dostupných od NEB (obrázek 4).

Budoucí Směry

Mnoho vlastností ovlivnit účinnost a užitečnost PCR polymerázová. Polymerázová aktivní Architektura stránek a korekturní činnost ovlivňují přesnost konečného produktu. Polymerázové směsi a fúze s DNA vazebným proteinem poskytují vynikající výkon PCR pro délku amplikonu a v případě chiméry reakční rychlost., Další důležité pokroky v PCR, jako jsou hot-start polymerázy pro zvýšení reakční specifičnost, multiplex PCR (Obrázek 5) a qPCR také revoluci ve vědách o životě.

jak dokazují upravené směsi a chiméry, vlastnosti samotné polymerázy mohou být modulovány pro zlepšení výkonu PCR. V budoucnu je pravděpodobné, že polymerázové vlastnosti budou stále více přizpůsobeny konkrétním aplikacím PCR, a jako takové je to důležitá oblast výzkumu v NEB.,

zobrazení grafu výběru DNA polymerázy NEB