v Mnoha biologických aplikacích, jako jsou mikrobiologie, buněčné kultury, krev a mnoho dalších, které používají buňky vyžadují, aby určit koncentraci buněk pro náš experiment.

Mobilní počítání je poměrně jednoduché a vyžaduje počítání komora nazývá hemocytometer, zařízení vynalezl v 19. století francouzský vědec Louis-Charles Malassez provést krvinek. Hemocytometr se skládá z tlustého skelného mikroskopického skluzu s mřížkou kolmých čar leptaných uprostřed., Mřížka má specifikované rozměry tak, aby byla známa oblast pokrytá čarami, což umožňuje počítat počet buněk v určitém objemu roztoku.

Obrázek 1. Klasický Hemocytometer

nejběžnějším typem hemocytometer má „H“ tvar ryté, uprostřed, která zahrnuje dva samostatné zrcadlo-jako leštěné mřížky plochy a poskytuje kryt skluzu montážní plochu (Obrázek 1).,

načítání hemocytometru

před spuštěním se ujistěte, že hemocytometr i jeho krytina jsou čisté odstraněním prachových částic čočkovým papírem. Kryty, které se používají k montáži na hemocytometry, jsou speciálně vyrobeny tak, aby byly tlustší než běžné mikroskopické kryty, protože musí být schopny překonat povrchové napětí kapky kapaliny.

ujistěte se, že nejprve umístěte kryt přes počítací plochu před načtením buněčné suspenze., Potom umístěte špičku pipety se vzorkem do jedné z jamek ve tvaru písmene V, jako na obrázku 2, a jemně vytlačte vzorek. Oblast pod krytem se vyplňuje kapilárním působením. Dostatek kapaliny by měl být zaveden tak, aby zrcadlový povrch byl jen zakrytý, obvykle kolem 10 µl, ale povrch nepřeplňujte. Na jeden hemocytometr můžete načíst dva vzorky, jeden do každé ze dvou sítí.

Obrázek 2., Načítání Hemocytometru

načtený hemocytometr se pak umístí na stupeň mikroskopu a počítací mřížka se zaostří při nízkém výkonu. Nechte vzorek usadit se na pár minut a vyhnout se pohybu coverslip, protože by to mohlo zavést vzduchové bubliny a ztěžovat počítání.

počítání buněk v hemocytometru

Plná mřížka na hemocytometru obsahuje devět čtverců, z nichž každá je 1 mm2 (obrázek 3). Centrální počítací Plocha hemocytometru (obrázek 3B) obsahuje 25 velkých čtverců a každý velký čtverec má 16 menších čtverců., Při počítání počítat pouze ty buňky na řádcích dvou stran velkého čtverce, aby se zabránilo počítání buněk dvakrát (obrázek 3G). Suspenze by měly být dostatečně zředěny, aby se buňky nebo jiné částice nepřekrývaly na mřížce a měly by být rovnoměrně rozloženy.

obrázek 3. Počítání buněk na Hemocytometru.

pro rozlišení mezi mrtvými a životaschopnými buňkami se vzorek často zředí určitou skvrnou, jako je trypan modrá., Tato metoda barvení, známá také jako barvení s vyloučením barviva, používá barvivo diazo, které selektivně proniká buněčnými membránami mrtvých buněk a barví je modře, zatímco není absorbováno membránami živých buněk, čímž vylučuje živé buňky z barvení. Při pohledu pod mikroskopem, mrtvé buňky se jeví jako tmavě modrá (viz Obrázek 4)

Obrázek 4. Trypan modré vyloučení živých buněk na Hemocytometru. (Šipka označuje příjem barviva přes membránu mrtvých buněk.,)

provést počítat, určit zvětšení potřebné k rozpoznat požadovaný typ buněk a systematicky počítat buňky ve vybraných čtvercích tak, aby celkový počet je přibližně 100 buněk, minimální počet buněk potřebných pro statisticky významný počet.

u velkých buněk můžete jednoduše spočítat buňky uvnitř čtyř velkých rohových čtverců (obrázek 3C-F) a středního (obrázek 3B). Pro hustou suspenzi malých buněk můžete chtít počítat buňky ve čtyřech vnějších a středních čtvercích centrálního čtverce (obrázek 3B) nebo provést zředěnou suspenzi.,

nezapomeňte, že pokud buňka překrývá rozhodnutí, počítejte ji jako „in“, pokud překrývá horní nebo pravé rozhodnutí, a „out“, pokud překrývá dolní nebo levé rozhodnutí (obrázek 3G).

oblast středního (Obrázek 3B) a každého rohu náměstí (Obrázek 3C-F) je 1 mm x 1 mm = 1 mm2: hloubka každého čtverce je 0,1 mm. Konečný objem každé náměstí v takové hloubce je 100nl.,

Jakmile jste získali celkový počet buněk, buněčné koncentrace může být vypočtena z následujícího vzorce:

Takže, například, pokud jste zředěného vzorku 1:1 s Trypanovou modř, a počítá 325 buňky v 4 rohové čtverce a centrální velké náměstí, celkem buněk / ml =

Pokud chcete vědět, kolik článků máte v původním vzorku, stačí vynásobit koncentraci buněk tím, že celkový objem vzorku. Pokud je například váš původní objem vzorku 5 ml, pak má váš vzorek celkem =