Další generace sekvenování

Úvod

sekvenování lidského genomu byl dokončen v roce 2003, po 13 letech mezinárodní spolupráce a investice ve výši 3 miliardy USD. Projekt Lidského Genomu použil Sanger sekvenování (byť silně optimalizované), hlavní metodou sekvenování DNA od svého vynálezu v roce 1970.

Dnes, poptávka po sekvenování roste exponenciálně, s velkým množstvím genomové DNA museli být analyzovány rychle, levně a přesně., Díky novým sekvenačním technologiím známým kolektivně jako sekvenování nové generace je nyní možné sekvenovat celý lidský genom během několika hodin.

sekvenování Sanger a sekvenování nové generace

princip sekvenování nové generace (NGS) je podobný principu sekvenování Sanger, který se spoléhá na kapilární elektroforézu. Genomický pramen je roztříštěný a báze v každém fragmentu jsou identifikovány emitovanými signály, když jsou fragmenty ligovány proti vláknu šablony.,
metoda Sanger vyžadovala samostatné kroky pro sekvenování, separaci (elektroforézou) a detekci, což ztěžovalo automatizaci přípravy vzorku a bylo omezeno propustností, škálovatelností a rozlišením. NGS metoda používá pole založené na sekvenování, která kombinuje techniky vyvinuté v Sanger sekvenování zpracovat miliony reakce paralelně, což vede k velmi vysoké rychlosti a propustnosti za sníženou cenu., Sekvenování genomu projekty, které trvalo mnoho let s Sanger metody mohou být nyní dokončena v hodinách s NGS, i když s kratší čtení délky (počet základen, které jsou řazeny v čase) a menší přesnost.,

Další generace metody sekvenování DNA má tři hlavní kroky:

• Knihovna příprava: knihovny jsou vytvořeny pomocí náhodných fragmentace DNA, následuje ligace s vlastní linkery
• Zesílení: knihovna je zesílen pomocí klonální amplifikace, metody a PCR
• Sekvenování: DNA je sekvenován pomocí jednoho z několika různých přístupů

Knihovna příprava

za Prvé, DNA je fragmentován a to buď enzymaticky nebo pomocí ultrazvuku (excitace pomocí ultrazvuku) k vytvoření menších pramenů., Adaptéry (krátké, dvouvláknové kusy syntetické DNA) jsou pak ligovány na tyto fragmenty pomocí DNA ligázy, enzymu, který spojuje řetězce DNA. Adaptéry umožňují sekvenci vázat se na komplementární protějšek.

Adaptéry jsou syntetizovány tak, že jeden konec je „lepit“, zatímco druhý je ‚tupý‘ (nesoudržných) s ohledem na vstup tupý konec tupý skončil DNA. To by mohlo vést k potenciálnímu problému párování bází mezi molekulami, a tedy k tvorbě dimerů., Aby se tomu zabránilo, používá se chemická struktura DNA, protože ligace probíhá mezi konci 3′-OH a 5′-p. Odstraněním fosfátů z lepkavé konce adaptéru, a proto vytváří 5′-OH konce, místo, DNA ligázy je schopen tvořit most mezi dvěma termini (Obrázek 1).,

V pořadí pro řazení, aby byla úspěšná, knihovna fragmenty musí být prostorově sdružené v PCR kolonií nebo ‚polonies‘ tak, jak jsou běžně známé, které se skládají z mnoha kopií určitého knihovna fragment. Vzhledem k tomu, že tyto polony jsou připojeny rovinným způsobem, lze s vlastnostmi pole manipulovat enzymaticky paralelně. Tento způsob výstavby knihovny je mnohem rychlejší než předchozí pracovně náročný postup sběru kolonií a e., coli klonování používá k izolaci a amplifikaci DNA pro Sanger sekvenování, nicméně, to je na úkor délky čtení fragmentů.

zesílení

je vyžadováno zesílení knihovny, takže přijatý signál z sekvenceru je dostatečně silný, aby byl přesně detekován. Při enzymatickém zesílení mohou nastat jevy, jako je „zkreslení“ a „duplikace“, což vede k preferenčnímu zesílení určitých fragmentů knihovny. Místo toho existuje několik typů amplifikačního procesu, které používají PCR k vytvoření velkého počtu shluků DNA.,

emulze PCR

emulzní olej, kuličky, PCR směs a knihovní DNA se smísí za vzniku emulze, která vede k tvorbě mikrozádků (Obrázek 2).

aby pro sekvenční proces, aby byla úspěšná, každý mikro měla obsahovat jeden korálek s jedním vláknem DNA (přibližně 15% micro studny jsou z této kompozice). PCR pak denaturuje fragment knihovny vedoucí dva samostatné prameny, z nichž jeden (reverzní Pramen) se skrývá na korálku., Žíhaná DNA je zesílena polymerázou začínající od korálku směrem k místu primeru. Původní reverzní pramen pak denaturuje a uvolňuje se z korálku pouze k opětovnému žíhání na korálek, aby se daly dva samostatné prameny. Oba jsou zesíleny tak, aby poskytly dva řetězce DNA připojené k perličce. Tento proces se pak opakuje v průběhu 30-60 cyklů vedoucích ke shlukům DNA. Tato technika byla kritizována za svou časově náročnou povahu, protože vyžaduje mnoho kroků (vytváření a lámání emulze, zesílení PCR, obohacení atd.), a to i přes jeho rozsáhlé použití v mnoha platformách NGS., Je také relativně neefektivní, protože pouze asi dvě třetiny emulzních mikro reaktorů budou ve skutečnosti obsahovat jednu kuličku. Proto je nutný další krok k oddělení prázdných systémů vedoucích k dalším možným nepřesnostem.

Most PCR

povrch průtoku mobilní je hustě potažené s primery, které jsou komplementární s primery připojeny k DNA knihovny fragmentů (Obrázek 3). DNA je pak náhodně připojena k povrchu buňky, kde je vystavena činidlům pro rozšíření na bázi polymerázy., Na doplnění nukleotidy a enzymy, volné konce jednoho vlákna DNA, připojit se k povrchu buňky prostřednictvím komplementární primery, vytvoření mostu struktur. Enzymy pak komunikovat s mosty, aby se jim dvouvláknová, tak, že při denaturaci dochází, dvě single pletl DNA fragmentů jsou připojeny na povrch v těsné blízkosti. Opakování tohoto procesu vede k klonálním shlukům lokalizovaných identických pramenů. Aby se optimalizovala hustota klastrů, musí být koncentrace činidel velmi pečlivě sledovány, aby se zabránilo přeplnění.,

Řazení

Několik konkurenčních metod Next Generation Sekvenování byly vyvinuty různými společnostmi.

454 Pyrosequencing

Pyrosequencing je založena na sekvenování syntézou‘ princip, kde se komplementární řetězec je syntetizován v přítomnosti enzymu polymerázy (Obrázek 4). V kontrastu k použití dideoxynucleotides ukončit zesílení řetězu (jako v Sanger sekvenování), pyrosequencing místo detekuje vydání pyrofosforečnan když nukleotidy jsou přidány do řetězce DNA., Zpočátku používá emulzní PCR techniku pro konstrukci polonií potřebných pro sekvenování a odstraňuje komplementární pramen. Další, ssDNA sequencing primer hybridizuje na konec vlákna (primer-binding region), pak čtyři různé dntp jsou pak postupně proudit dovnitř a ven ze studny přes polonies. Když je správný dNTP enzymaticky začleněn do pramene, způsobuje uvolňování pyrofosfátu. V přítomnosti ATP sulfurylázy a adenosinu se pyrofosfát převede na ATP., Tato molekula ATP je použita pro luciferase-katalyzuje přeměnu luciferin na oxyluciferin, který produkuje světlo, které mohou být detekovány s kamerou. Relativní intenzita světla je úměrná množství přidané báze(tj. vrchol dvojnásobné intenzity udává, že byly postupně přidány dvě identické báze).,

Pyrosequencing, vyvinutý společností 454 Life Sciences, byl jedním z prvních úspěchů Next-generation sekvenování; vskutku, 454 Life Sciences vyrobila první komerčně dostupný Příští generace sekvenceru. Metoda však byla zastíněna jinými technologiemi a v roce 2013 noví majitelé Roche oznámili uzavření 454 věd o životě a ukončení platformy 454 pyrosequencing.,

Ion torrent polovodičového sekvenování

Ion torrent sekvenování používá „sekvenování syntézou“ přístup, v němž se nový řetězec DNA, komplementární k cílové pramen, který je syntetizován jedné základny současně. Polovodičový čip detekuje vodíkové ionty produkované během polymerace DNA (obrázek 5).

po vytvoření polony pomocí emulze PCR je fragment knihovny DNA postupně zaplaven každým nukleosidtrifosfátem (dNTP), jako při pyrosekvencování. DNTP je pak začleněn do nového řetězce, pokud je komplementární k nukleotidu na cílovém řetězci., Pokaždé, když se úspěšně přidá nukleotid, uvolní se vodíkový iont a detekuje se sekvencerovým pH senzorem. Stejně jako u metody pyrosekvenování, pokud je přidáno více než jeden ze stejných nukleotidů, změna intenzity pH/signálu je odpovídajícím způsobem větší.

Ion torrent sekvenování je první komerční techniku nepoužívat fluorescence a fotoaparát skenování; je proto rychlejší a levnější než mnoho jiných metod., Bohužel může být obtížné vyčíslit počet stejných základen přidaných postupně. Například může být obtížné rozlišit změnu pH pro homorepeat délky 9 na jednu z délky 10, což ztěžuje dekódování opakovaných sekvencí.

Sekvenování ligací (SOLiD)

Solidní je enzymatická metoda sekvenování, která používá DNA ligase, enzym široce využívány v biotechnologii pro svou schopnost podvázat double-stranded DNA (Obrázek 6)., Emulzní PCR se používá pro imobilizaci/zesílit ssDNA primer-závazné regionu (tzv. adaptér), který byl konjugován na cílové sekvence (tj. sekvence, která má být sekvenován) na korálek. Tyto korálky se pak ukládají na skleněný povrch − lze dosáhnout vysoké hustoty korálků, což zase zvyšuje propustnost techniky.

Jednou korálek depozice došlo, primer o délce N je hybridizován k adaptéru, a pak korálky jsou vystaveny knihovna 8-mer sondy, které mají různé fluorescenční barvivo na 5′ konci a hydroxylovou skupinou na 3′ konci., Základy 1 a 2 jsou komplementární nukleotidy být sekvenován, zatímco základny 3-5 jsou degenerované a základny 6-8 jsou inosin základny. Pouze komplementární sonda hybridizuje s cílovou sekvencí, přiléhající k primeru. Dna ligáza se pak používá k připojení sondy 8-mer k primeru. Spojení fosforothioátu mezi bázemi 5 a 6 umožňuje štěpení fluorescenčního barviva z fragmentu pomocí iontů stříbra., Toto štěpení umožňuje měření fluorescence (používají se čtyři různá fluorescenční barviva, z nichž všechna mají různá emisní spektra) a také vytváří 5′-fosfátovou skupinu, která může podstoupit další ligaci. Po dokončení prvního kola sekvenování se prodlužovací produkt roztaví a poté se perfomuje druhé kolo sekvenování základním nátěrem délky N−1. Mnoho kol sekvenování pomocí kratších primerů pokaždé (tj. N-2, N−3 atd.) a měření fluorescence zajišťuje sekvenaci cíle.,

Vzhledem k dvou-základní metoda sekvenování (od každé základny je účinně sekvenován dvakrát), Solidní technika je velmi přesný (na 99.999% s šestým primer, to je nejpřesnější druhé generace platformy) a také levná. Může dokončit jeden běh za 7 dní a v té době může produkovat 30 Gb dat. Bohužel, jeho hlavní nevýhodou je, že délky čtení jsou krátké, což je nevhodné pro mnoho aplikací.,

Reverzibilní terminátor sekvenování (Illumina)

Reverzibilní terminátor sekvenování se liší od tradičního Sangerova metoda v tom, že místo ukončení primer extension nevratně pomocí dideoxynucleotide, modifikované nukleotidy jsou používány ve reverzibilní ukončení. Zatímco mnoho jiných technik používá emulzní PCR k zesílení fragmentů knihovny DNA, reverzibilní ukončení používá Bridge PCR, což zlepšuje účinnost této fáze procesu.,

Reverzibilní terminátory lze rozdělit do dvou kategorií: 3′-O-blokované reverzibilní terminátory a 3′-odblokování reverzibilní terminátory.

3′-O-blokované reverzibilní terminátory

tento mechanismus používá sekvenování syntézou přístup, prodlužující primer v krocích. Za prvé, sekvenční primery a šablony jsou připevněny k pevné podpoře. Podpora je vystavena každé ze čtyř dna bází, které mají kromě 3′-o-azidomethylové skupiny (Obrázek 7) připojen jiný fluorofor (k dusíkaté bázi).,

Pouze správnou základnu anneals k cíli a následně ligován do čítanky. Plná podpora je pak zobrazen a nukleotidů, které nebyly začleněny jsou odplaveny a fluorescenční pobočka je štěpen pomocí TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine). TCEP také odstraní skupinu 3 ‚-o-azidomethyl, regeneruje 3 ‚ – OH a cyklus se může opakovat (Obrázek 8) .,

3′-odblokování reverzibilní terminátory

reverzibilní ukončení skupina 3′-odblokování reverzibilní terminátory je spojeno s oběma základní a fluorescenční skupinu, která nyní působí jako součást ukončení skupiny, stejně jako reportér. Tato metoda se liší od metody reverzibilních terminátorů 3 ‚- o-blokovaných třemi způsoby: Za prvé, pozice 3 ‚ není blokována (tj., základna má volné 3 ‚ – OH); fluorofor je stejný pro všechny čtyři základny; a každá modifikovaná základna proudí postupně spíše než současně.

hlavní nevýhodou těchto technik je jejich špatná délka čtení, která může být způsobena jedním ze dvou jevů. Aby se zabránilo začlenění dvou nukleotidů v jednom kroku, blok je kladen na místě, nicméně v případě, že žádný blok sčítání kvůli špatnému syntéza, prameny se může stát z fáze vytváření hluku, který omezuje číst délky. Hluk může být také vytvořen, pokud je fluorofor neúspěšně připojen nebo odstraněn., Tyto problémy jsou převládající v jiných sekvenačních metod a jsou hlavními omezujícími faktory pro délku čtení.

tato technika byla průkopníkem Illumina, s jejich platformami HiSeq a MiSeq. HiSeq je nejlevnější z sekvencerů druhé generace s cenou 0, 02 $na milion základen. Má také vysoký datový výkon 600 Gb za běh, který trvá přibližně 8 dní.

Třetí generace sekvenování

nová kohorta techniky od té doby byla vyvinuta pomocí sekvenování jedné molekuly a jeden reálném čase sekvenování, že odstraní potřebu pro klonální amplifikaci., To snižuje chyby způsobené PCR, zjednodušuje přípravu knihovny a, co je nejdůležitější, dává mnohem vyšší délku čtení pomocí vyšších platforem propustnosti. Příklady zahrnují Pacific Biosciences‘ platforma, která používá SMRT (single molecule real-time) sekvenování dát přečíst délky přibližně jeden tisíc základen a Helicos Biosciences, která využívá single molecule sequencing, a proto nevyžaduje zesílení před sekvenování. Oxford Nanopore Technologies jsou v současné době vyvíjí křemíkové bázi nanopórů, které jsou vystaveny aktuální, že změny DNA prochází pórů., To předpokládá vysokou propustností rychlá metoda sekvenování DNA, i když problémy, jako je zpomalení dopravy prostřednictvím pórů, musí být nejprve řešena.

sekvenování epigenetických modifikací

stejně jako sekvenování příští generace umožnilo genomické sekvenování v masivním měřítku, nedávno bylo jasné, že genetický kód neobsahuje všechny informace potřebné organismy. Epigenetické modifikace dna bází, zejména 5-methylcytosinu, také předávají důležité informace.,

všechny platformy sekvenování druhé generace závisí, jako je sekvenování Sanger, na PCR, a proto nemohou sekvenovat modifikované dna báze. Ve skutečnosti jsou enzymy zapojené do PCR léčeny jako cytosin 5-methylcytosin a 5-hydroxymethylcytosin; proto se epigenetické informace během sekvenování ztrácejí.,

Bisulfite sequencing

Bisulfite sequencing využije rozdíl v reaktivitě cytosinu a 5-methylcytosine s ohledem na bisulfite: cytosin je deaminated bisulfite tvořit uracil (což se čte jako T, když sekvenován), vzhledem k tomu, 5-methylcytosine je nereaktivní (tj. čte jako C). Pokud jsou paralelně prováděny dva sekvenační běhy, jeden s léčbou bisulfitem a jeden bez, rozdíly mezi výstupy obou běhů naznačují methylované cytosiny v původní sekvenci., Tato technika může být také použita pro dsDNA, protože po ošetření bisulfitem již prameny nejsou komplementární a mohou být považovány za ssDNA.

5-Hydroxymethylcytosine, další důležité epigenetické modifikace, reaguje s bisulfite tvořit cytosin-5-methylsulfonate (což se čte jako C, když sekvenován). To poněkud komplikuje záležitosti a znamená, že sekvenování bisulfitu nemůže být samo o sobě používáno jako skutečný ukazatel methylace.,

Oxidační bisulfite sequencing

Oxidační bisulfite sequencing dodává chemické oxidace krok, který převádí 5-hydroxymethylcytosine 5-formylcytosine pomocí draslíku perruthenate, KRuO4, než bisulfite léčby. 5-Formylcytosin je deformován a deaminován za vzniku uracilu léčbou bisulfitem. Nyní jsou k rozlišení cytosinu, 5-methylcytosinu a 5-hydroxymethylcytosinu nezbytné tři samostatné sekvenační běhy (viz obrázek 9).,

Aplikace Příští generace sekvenování

Další generace sekvenování umožnila výzkumníkům shromažďovat obrovské množství genomické sekvenční data., Tato technologie má nepřeberné množství aplikací, jako jsou: diagnostika a pochopení komplexních onemocnění; celek-sekvenování genomu; analýza epigenetické modifikace; mitochondriální sekvenování; transcriptome sequencing − pochopení toho, jak se změněné expresi genetické varianty ovlivňuje organismus; a exome sequencing − mutace v exome se, že obsahuje až 90% mutací v lidském genomu, což vede k onemocnění., DNA techniky byly použity k identifikaci a izolaci genů odpovědných za určité nemoci a poskytnout správnou kopii defektního genu známého jako „genová terapie“.

velký důraz v oblasti genové terapie je léčba rakoviny – jeden možný způsob by bylo zavést antisense RNA (které konkrétně brání syntéze cíleného proteinu) onkogenu, který se spustí, tvořit nádorové buňky. Další metoda se jmenuje „sebevražedná genová terapie“, která zavádí geny k selektivnímu zabíjení rakovinných buněk., Je známo mnoho genetických kódů toxických proteinů a enzymů a zavedení těchto genů do nádorových buněk by vedlo k buněčné smrti. Obtížnost této metody spočívá v zajištění velmi přesného dodacího systému, který zabrání zabíjení zdravých buněk.
Tyto metody jsou možné díky sekvenování pro analýzu nádorových genomů, což lékařských odborníků na míru chemoterapie a další léčby rakoviny více účinně k jejich pacientů jedinečné genetické složení, revoluční diagnostické fáze personalizované medicíny.,

vzhledem k tomu, že náklady na sekvenování DNA klesají, bude rozšířenější, což přináší řadu problémů. Sekvenování vytváří obrovské objemy dat a existuje mnoho výpočetních výzev spojených se zpracováním a ukládáním dat. Existují také etické otázky, jako je vlastnictví dna jednotlivce, když je dna sekvenována. Data sekvenování DNA musí být bezpečně uložena, protože existují obavy, že pojišťovací skupiny, hypoteční makléři a zaměstnavatelé mohou tyto údaje použít k úpravě pojistných nabídek nebo rozlišování mezi kandidáty., Sekvenování může také pomoci zjistit, zda má jednotlivec zvýšené riziko pro konkrétní onemocnění, ale zda je pacient informován nebo zda existuje lék na onemocnění, je úplně jiný problém.

Ahmadian, a.; Svahn, h.; masivně paralelní. Sekvenční platformy využívající laboratoř na čipových technologiích. Laboratorní Čip, 11, 2653 − 2655 (2011).

Balasubramanian, s.; sekvenování nukleových kyselin: od chemie po medicínu. Chem. Commune. 47, 7281 − 7286 (2011).

Mardis, E.; metody sekvenování DNA nové generace. Annu. Rev. Genomics Hum. Genete. 9, 387 − 402 (2008).

Mardis, e.,; Platformy pro sekvenování DNA nové generace. Annu. Rev.Anální. Chem. 6, 287-303 (2013).

Shendure, J.; Ji, h.; sekvenování DNA nové generace. Adresa. Biotechnologie. 26, 10 1135-1144 (2008).

Viz také

naše bezplatná online kniha nukleových kyselin obsahuje informace o všech aspektech chemie a biologie nukleových kyselin.