Next generation Sequencing

Einführung

Die Sequenzierung des menschlichen Genoms wurde 2003 nach 13 Jahren internationaler Zusammenarbeit und Investitionen in Höhe von USD 3 Milliarden abgeschlossen. Das Human Genome Project verwendete die Sanger-Sequenzierung (wenn auch stark optimiert), die Hauptmethode der DNA-Sequenzierung seit ihrer Erfindung in den 1970er Jahren.

Heute wächst der Bedarf an Sequenzierung exponentiell, wobei große Mengen genomischer DNA schnell, kostengünstig und genau analysiert werden müssen., Dank neuer Sequenzierungstechnologien, die gemeinsam als Next Generation Sequencing bekannt sind, ist es jetzt möglich, ein ganzes menschliches Genom in wenigen Stunden zu sequenzieren.

Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequenzierung

Das Prinzip hinter Next Generation Sequenzierung (NGS) ist ähnlich dem der Sanger-Sequenzierung, die auf Kapillarelektrophorese beruht. Der genomische Strang ist fragmentiert, und die Basen in jedem Fragment werden durch emittierte Signale identifiziert, wenn die Fragmente gegen einen Template-Strang ligiert werden.,
Die Sangermethode erforderte getrennte Schritte für Sequenzierung, Trennung (durch Elektrophorese) und Detektion, was die Automatisierung der Probenvorbereitung erschwerte und in Durchsatz, Skalierbarkeit und Auflösung begrenzt war. Die NGS-Methode verwendet Array-basierte Sequenzierung, die die in der Sanger-Sequenzierung entwickelten Techniken kombiniert, um Millionen von Reaktionen parallel zu verarbeiten, was zu sehr hoher Geschwindigkeit und Durchsatz zu reduzierten Kosten führt., Die Genomsequenzierungsprojekte, die viele Jahre mit Sanger-Methoden gedauert haben, können jetzt in Stunden mit NGS abgeschlossen werden, wenn auch mit kürzeren Leselängen (die Anzahl der Basen, die gleichzeitig sequenziert werden) und weniger Genauigkeit.,

Methoden der nächsten Generation der DNA-Sequenzierung haben drei allgemeine Schritte:

• Bibliotheksvorbereitung: Bibliotheken werden mit zufälliger Fragmentierung von DNA erstellt, gefolgt von Ligation mit benutzerdefinierten Linkern
• Amplifikation: Die Bibliothek wird mit klonalen Amplifikationsmethoden und PCR amplifiziert
• Sequenzierung: DNA wird mit einem von mehreren verschiedenen Ansätzen sequenziert

Bibliotheksvorbereitung

Erstens wird DNA entweder enzymatisch oder durch sonication (Anregung mit Ultraschall), um kleinere Stränge zu erzeugen., Adapter (kurze, doppelsträngige Stücke synthetischer DNA) werden dann mit Hilfe von DNA-Ligase, einem Enzym, das DNA-Stränge verbindet, an diese Fragmente ligiert. Die Adapter ermöglichen es, die Sequenz an ein komplementäres Gegenstück zu binden.

Adapter werden so synthetisiert, dass ein Ende „klebrig“ ist, während das andere „stumpf“ (nicht kohäsiv) ist, um das stumpfe Ende mit der stumpfen DNA zu verbinden. Dies könnte zu dem potenziellen Problem der Basenpaarung zwischen Molekülen und damit der Dimerbildung führen., Um dies zu verhindern, wird die chemische Struktur der DNA genutzt, da die Ligation zwischen den 3′-OH-und 5 ‚ – P-Enden stattfindet. Durch die Entfernung des Phosphats vom klebrigen Ende des Adapters und daher durch die Schaffung eines 5‘-OH-Endes kann die DNA-Ligase keine Brücke zwischen den beiden Termini bilden (Abbildung 1).,

Damit die Sequenzierung erfolgreich ist, müssen die Bibliotheksfragmente räumlich in PCR-Kolonien oder, wie sie üblicherweise bekannt sind, in „polonies“ geclustert werden, die aus vielen Kopien eines bestimmten Bibliotheksfragments bestehen. Da diese Polonien planar angebracht sind, können die Merkmale des Arrays enzymatisch parallel manipuliert werden. Diese Methode des Bibliotheksbaus ist viel schneller als das vorherige arbeitsintensive Verfahren der Kolonie Kommissionierung und E., coli-Klonen verwendet DNA für Sanger-Sequenzierung zu isolieren und zu amplifizieren, jedoch ist dies auf Kosten der Leselänge der Fragmente.

Verstärkung

Eine Verstärkung der Bibliothek ist erforderlich, damit das empfangene Signal vom Sequenzer stark genug ist, um genau erfasst zu werden. Bei der enzymatischen Amplifikation können Phänomene wie „Biasing“ und „Duplication“ auftreten, die zu einer bevorzugten Amplifikation bestimmter Bibliotheksfragmente führen. Stattdessen gibt es verschiedene Arten von Amplifikationsprozessen, die PCR verwenden, um eine große Anzahl von DNA-Clustern zu erstellen.,

Emulsion PCR

Emulsionsöl, Perlen, PCR-Mischung und die Bibliotheks-DNA werden zu einer Emulsion gemischt, die zur Bildung von Mikrobrunnen führt (Abbildung 2).

Damit der Sequenzierungsprozess erfolgreich ist, sollte jeder Mikrobrunnen eine Perle mit einem DNA-Strang enthalten (ungefähr 15% der Mikrobrunnen sind aus dieser Zusammensetzung). Die PCR bezeichnet dann das Bibliotheksfragment, das zwei separate Stränge führt, von denen einer (der umgekehrte Strang) zum Wulst glüht., Die geglühte DNA wird durch Polymerase ausgehend von der Perle zur Primerstelle amplifiziert. Der ursprüngliche umgekehrte Strang denaturiert dann und wird von der Perle nur freigegeben, um die Perle wieder zu glühen, um zwei separate Stränge zu geben. Diese werden beide amplifiziert, um zwei DNA-Stränge zu ergeben, die an der Perle befestigt sind. Der Prozess wird dann über 30-60 Zyklen wiederholt, was zu DNA-Clustern führt. Diese Technik wurde wegen ihres zeitaufwändigen Charakters kritisiert, da sie trotz ihres umfangreichen Einsatzes auf vielen NGS-Plattformen viele Schritte erfordert (Formen und Brechen der Emulsion, PCR-Verstärkung, Anreicherung usw.)., Es ist auch relativ ineffizient, da nur etwa zwei Drittel der Emulsionsmikroreaktoren tatsächlich eine Perle enthalten. Daher ist ein zusätzlicher Schritt erforderlich, um leere Systeme zu trennen, was zu mehr potenziellen Ungenauigkeiten führt.

PCR

Die Oberfläche der Durchflusszelle ist dicht mit Primern beschichtet, die komplementär zu den Primern sind, die an die DNA-Bibliotheksfragmente gebunden sind (Abbildung 3). Die DNA wird dann zufällig an die Oberfläche der Zelle gebunden, wo sie Reagenzien für die Polymerase-basierte Erweiterung ausgesetzt wird., Bei Zugabe von Nukleotiden und Enzymen heften sich die freien Enden der einzelnen DNA-Stränge über komplementäre Primer an die Oberfläche der Zelle und bilden überbrückte Strukturen. Enzyme interagieren dann mit den Brücken, um sie doppelsträngig zu machen, so dass bei der Denaturierung zwei einzelsträngige DNA-Fragmente in unmittelbarer Nähe an der Oberfläche befestigt werden. Wiederholung dieses Prozesses führt zu klonalen Clustern von lokalisierten identischen Strängen. Um die Clusterdichte zu optimieren, müssen die Konzentrationen von Reagenzien sehr genau überwacht werden, um eine Überfüllung zu vermeiden.,

Sequencing

Mehrere konkurrierende Methoden der Next-Generation-Sequenzierung wurden von verschiedenen Unternehmen entwickelt wurden.

454 Pyrosequenzierung

Die Pyrosequenzierung basiert auf dem Prinzip „sequencing by synthesis“, bei dem ein komplementärer Strang in Gegenwart eines Polymerase-Enzyms synthetisiert wird (Abbildung 4). Im Gegensatz zur Verwendung von Dideoxynukleotiden zur Beendigung der Kettenamplifikation (wie bei der Sanger-Sequenzierung) erkennt die Pyrosequenzierung stattdessen die Freisetzung von Pyrophosphat, wenn Nukleotide zur DNA-Kette hinzugefügt werden., Es verwendet zunächst die Emulsions-PCR-Technik, um die Polonies zu konstruieren, die für die Sequenzierung erforderlich sind, und entfernt den komplementären Strang. Als nächstes hybridisiert ein ssDNA-Sequenzierprimer bis zum Ende des Strangs (Primer-Bindungsbereich), dann werden die vier verschiedenen dNTPs sequentiell so hergestellt, dass sie über die Polonies in die Vertiefungen ein-und aus diesen fließen. Wenn das richtige dNTP enzymatisch in den Strang eingebaut wird, verursacht es die Freisetzung von Pyrophosphat. In Gegenwart von ATP-Sulfurylase und Adenosin wird das Pyrophosphat in ATP umgewandelt., Dieses ATP-Molekül wird zur Luciferase-katalysierten Umwandlung von Luciferin in Oxyluciferin verwendet, wodurch Licht erzeugt wird, das mit einer Kamera detektiert werden kann. Die relative Intensität des Lichts ist proportional zur Menge der hinzugefügten Base (dh ein Peak von der doppelten Intensität zeigt an, dass zwei identische Basen nacheinander hinzugefügt wurden).,

Pyrosequencing, entwickelt von 454 Life Sciences, war einer der frühen Erfolge der Next-generation-sequencing; in der Tat, 454 Life Sciences produzierte die ersten kommerziell verfügbaren Next-generation sequencer. Die Methode wurde jedoch von anderen Technologien in den Schatten gestellt, und 2013 kündigten neue Eigentümer Roche die Schließung von 454 Life Sciences und die Einstellung der 454 Pyrosequenzierungsplattform an.,

Ion torrent semiconductor sequencing

Ion torrent Sequencing verwendet einen „Sequencing by synthesis“ – Ansatz, bei dem ein neuer DNA-Strang, komplementär zum Zielstrang, eine Base nach der anderen synthetisiert wird. Ein Halbleiterchip detektiert die während der DNA-Polymerisation erzeugten Wasserstoffionen (Abbildung 5).

Nach Polonybildung mittels Emulsions-PCR wird das DNA-Bibliotheksfragment sequentiell mit jedem Nukleosidtriphosphat (dNTP) geflutet, wie in der Pyrosequenzierung. Das dNTP wird dann in den neuen Strang eingebaut, wenn es komplementär zum Nukleotid auf dem Zielstrang ist., Jedes Mal, wenn ein Nukleotid erfolgreich hinzugefügt wird, wird ein Wasserstoffion freigesetzt und vom pH-Sensor des Sequenzers detektiert. Wie bei der Pyrosequenzierungsmethode ist die Änderung der pH/Signalintensität entsprechend größer, wenn mehr als eines desselben Nukleotids hinzugefügt wird.

Ion torrent sequencing ist die erste kommerzielle Technik nicht zu verwenden, Fluoreszenz-und Kamera-Scannen; es ist daher schneller und günstiger als viele andere Methoden., Leider kann es schwierig sein, die Anzahl der nacheinander hinzugefügten identischen Basen aufzuzählen. Beispielsweise kann es schwierig sein, die pH-Änderung für ein Homorepeat der Länge 9 von einem der Länge 10 zu unterscheiden, was es schwierig macht, sich wiederholende Sequenzen zu dekodieren.

Sequenzierung durch Ligation (Feststoff)

Feststoff ist eine enzymatische Sequenzierungsmethode, bei der DNA-Ligase verwendet wird, ein in der Biotechnologie weit verbreitetes Enzym für seine Fähigkeit, doppelsträngige DNA-Stränge zu ligieren (Abbildung 6)., Emulsions-PCR wird verwendet, um einen ssDNA-Primer-Bindungsbereich (bekannt als Adapter) zu immobilisieren/amplifizieren, der an die Zielsequenz (dh die Sequenz, die sequenziert werden soll) auf einer Perle konjugiert wurde. Diese Perlen werden dann auf eine Glasoberfläche abgeschieden − es kann eine hohe Dichte von Perlen erreicht werden, was wiederum den Durchsatz der Technik erhöht.

Sobald die Perlenabscheidung stattgefunden hat, wird eine Grundierung der Länge N mit dem Adapter hybridisiert, dann werden die Perlen einer Bibliothek von 8-mer-Sonden ausgesetzt, die am 5-Ende unterschiedliche fluoreszierende Farbstoffe und am 3-Ende eine Hydroxylgruppe aufweisen., Die Basen 1 und 2 ergänzen die zu sequenzierenden Nukleotide, während die Basen 3-5 degeneriert und die Basen 6-8 Inosinbasen sind. Nur eine komplementäre Sonde hybridisiert mit der Zielsequenz neben dem Primer. DNA-Ligase wird dann verwendet, um die 8-mer-Sonde mit dem Primer zu verbinden. Durch eine Phosphorothioatverbindung zwischen den Basen 5 und 6 kann der fluoreszierende Farbstoff unter Verwendung von Silberionen aus dem Fragment gespalten werden., Diese Spaltung ermöglicht die Messung der Fluoreszenz (es werden vier verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, die alle unterschiedliche Emissionsspektren aufweisen) und erzeugt auch eine 5′-Phosphatgruppe, die einer weiteren Ligation unterzogen werden kann. Sobald die erste Sequenzierungsrunde abgeschlossen ist, wird das Verlängerungsprodukt abgeschmolzen und dann eine zweite Sequenzierungsrunde mit einer Grundierung der Länge N−1 perfektioniert. Viele Sequenzierungsrunden mit jeweils kürzeren Primern (dh N−2, N−3 usw.) und die Messung der Fluoreszenz stellen sicher, dass das Ziel sequenziert wird.,

Aufgrund der Zwei-Basen-Sequenzierungsmethode (da jede Basis effektiv zweimal sequenziert wird) ist die Feststofftechnik sehr genau (bei 99,999% mit einem sechsten Primer ist sie die genaueste der Plattformen der zweiten Generation) und auch kostengünstig. Es kann einen einzelnen Lauf in 7 Tagen abschließen und in dieser Zeit 30 Gb Daten erzeugen. Leider ist sein Hauptnachteil, dass Leselängen kurz sind, so dass es für viele Anwendungen ungeeignet.,

Reversible Terminatorsequenzierung (Illumina)

Reversible Terminatorsequenzierung unterscheidet sich von der traditionellen Sanger-Methode dadurch, dass anstelle der irreversiblen Beendigung der Primererweiterung unter Verwendung von Dideoxynukleotid modifizierte Nukleotide in reversibler Terminierung verwendet werden. Während viele andere Techniken Emulsions-PCR verwenden, um die DNA-Bibliotheksfragmente zu amplifizieren, verwendet die reversible Terminierung Brücken-PCR, um die Effizienz dieser Phase des Prozesses zu verbessern.,

Reversible Terminatoren können in zwei Kategorien eingeteilt werden: 3′-O-blockierte reversible Terminatoren und 3′-entsperrte reversible Terminatoren.

3′-O-blockierte reversible Terminatoren

Der Mechanismus verwendet einen Sequenzierungs-durch-Synthese-Ansatz, der den Primer schrittweise verlängert. Erstens sind die Sequenzierprimer und-vorlagen an einer soliden Unterstützung befestigt. Der Träger ist jeder der vier DNA-Basen ausgesetzt, an die zusätzlich zu einer 3′-O-Azidmethylgruppe ein anderer Fluorophor (an die stickstoffhaltige Base) gebunden ist (Abbildung 7).,

Nur die richtige Basis glüht auf das Ziel und wird anschließend an den Primer ligiert. Der feste Träger wird dann abgebildet und Nukleotide, die nicht eingebaut wurden, werden weggespült und der fluoreszierende Zweig wird unter Verwendung von TCEP (tris(2-Carboxyethyl)Phosphin) gespalten. TCEP entfernt auch die 3′ – O-Azidmethylgruppe und regeneriert 3′-OH, und der Zyklus kann wiederholt werden (Abbildung 8) .,

3′-unblocked reversible Terminatoren

Die reversible Terminatorgruppe von 3′-unblocked reversible Terminatoren ist sowohl mit der Basis-als auch der Fluoreszenzgruppe verknüpft, die nun als Teil der Terminationsgruppe sowie als Reporter fungiert. Diese Methode unterscheidet sich von der 3′-O-blocked reversible Terminators-Methode auf drei Arten: Erstens wird die 3′-Position nicht blockiert (dh, die Basis hat freie 3′ – OH); Der Fluorophor ist für alle vier Basen gleich; und jede modifizierte Basis wird sequentiell und nicht gleichzeitig eingeflossen.

Der Hauptnachteil dieser Techniken liegt in ihrer schlechten Leselänge, die durch eines von zwei Phänomenen verursacht werden kann. Um den Einbau von zwei Nukleotiden in einem einzigen Schritt zu verhindern, wird ein Block eingesetzt, jedoch können im Falle einer Blockadadaddition aufgrund einer schlechten Synthese Stränge aus der Phase herausfallen und Rauschen erzeugen, das die Leselänge begrenzt. Lärm kann auch erzeugt werden, wenn der Fluorophor erfolglos angebracht oder entfernt wird., Diese Probleme sind in anderen Sequenzierungsmethoden weit verbreitet und sind die wichtigsten limitierenden Faktoren für die Leselänge.

Diese Technik wurde von Illumina mit ihren Plattformen HiSeq und MiSeq entwickelt. HiSeq ist der billigste Sequenzer der zweiten Generation mit einem Preis von 0,02 USD pro Million Basen. Es hat auch eine hohe Datenausgabe von 600 Gb pro Lauf, die etwa 8 Tage dauert.

Sequenzierung der dritten Generation

Seitdem wurde eine neue Kohorte von Techniken unter Verwendung von Einzelmolekülsequenzierung und Einzel-Echtzeit-Sequenzierung entwickelt, wodurch die Notwendigkeit einer klonalen Amplifikation entfällt., Dies reduziert Fehler, die durch PCR verursacht werden, vereinfacht die Bibliotheksvorbereitung und bietet vor allem eine viel höhere Leselänge bei Verwendung von Plattformen mit höherem Durchsatz. Beispiele hierfür sind die Pacific Biosciences-Plattform, die die SMRT-Sequenzierung (Single Molecule Real Time) verwendet, um Leselängen von rund tausend Basen zu erhalten, und Helicos Biosciences, die die Sequenzierung von Einzelmolekülen verwendet und daher vor der Sequenzierung keine Amplifikation erfordert. Oxford Nanopore Technologies entwickelt derzeit Nanoporen auf Siliziumbasis, die einem Strom ausgesetzt sind, der sich ändert, wenn DNA die Pore passiert., Es wird erwartet, dass dies eine schnelle Methode mit hohem Durchsatz bei der DNA-Sequenzierung ist, obwohl Probleme wie die Verlangsamung des Transports durch die Pore zuerst angegangen werden müssen.

Sequenzierung epigenetischer Modifikationen

So wie die Sequenzierung der nächsten Generation die genomische Sequenzierung in großem Maßstab ermöglichte, ist in letzter Zeit klar geworden, dass der genetische Code nicht alle von Organismen benötigten Informationen enthält. Epigenetische Modifikationen an DNA-Basen, insbesondere 5-Methylcytosin, vermitteln ebenfalls wichtige Informationen.,

Alle Sequenzierplattformen der zweiten Generation hängen wie die Sanger-Sequenzierung von der PCR ab und können daher keine modifizierten DNA-Basen sequenzieren. Tatsächlich werden sowohl 5-Methylcytosin als auch 5-Hydroxymethylcytosin von den an der PCR beteiligten Enzymen als Cytosin behandelt; Daher gehen epigenetische Informationen während der Sequenzierung verloren.,

Bisulfit-Sequenzierung

Die Bisulfit-Sequenzierung nutzt den Unterschied in der Reaktivität von Cytosin und 5-Methylcytosin in Bezug auf Bisulfit aus: Cytosin wird durch Bisulfit zu Uracil desaminiert (was bei Sequenzierung als T liest), während 5-Methylcytosin unreaktiv ist (dh als C liest). Wenn zwei Sequenzierungsläufe parallel durchgeführt werden, einer mit Bisulfitbehandlung und einer ohne, zeigen die Unterschiede zwischen den Ausgängen der beiden Läufe methylierte Zytosinen in der ursprünglichen Sequenz an., Diese Technik kann auch für dsDNA verwendet werden, da nach der Behandlung mit Bisulfit die Stränge nicht mehr komplementär sind und als ssDNA behandelt werden können.

5-Hydroxymethylcytosin, eine weitere wichtige epigenetische Modifikation, reagiert mit Bisulfit zu Cytosin-5-Methylsulfonat (das bei Sequenzierung als C liest). Dies erschwert die Sache etwas und bedeutet, dass die Bisulfitsequenzierung nicht als echter Indikator für die Methylierung an sich verwendet werden kann.,

Oxidative Bisulfitsequenzierung

Die oxidative Bisulfitsequenzierung fügt einen chemischen Oxidationsschritt hinzu, der 5-Hydroxymethylcytosin unter Verwendung von Kaliumperruthenat, Phospho4, vor der Bisulfitbehandlung in 5-Formylcytosin umwandelt. 5-Formylcytosin wird deformiert und desaminiert, um Uracil durch Bisulfitbehandlung zu bilden. Nun sind drei separate Sequenzierungsläufe erforderlich, um Cytosin, 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin zu unterscheiden (siehe Abbildung 9).,

Anwendung von Next-generation-sequencing

Next generation sequencing ermöglichte den Forschern zu sammeln riesige Mengen an genomischen Sequenzdaten., Diese Technologie hat eine Vielzahl von Anwendungen, wie zum Beispiel: Diagnose und Verständnis komplexer Krankheiten; Sequenzierung des gesamten Genoms; Analyse epigenetischer Modifikationen; mitochondriale Sequenzierung; Transkriptomsequenzierung-Verstehen, wie sich veränderte Expression genetischer Varianten auf einen Organismus auswirken; und Exomsequenzierung-Mutationen im Exom enthalten vermutlich bis zu 90% der Mutationen im menschlichen Genom, was zu Krankheiten führt., DNA-Techniken wurden verwendet, um Gene zu identifizieren und zu isolieren, die für bestimmte Krankheiten verantwortlich sind, und die korrekte Kopie des defekten Gens bereitzustellen, das als „Gentherapie“ bezeichnet wird.

Ein großer Schwerpunkt in der Gentherapie ist die Krebsbehandlung – eine mögliche Methode wäre die Einführung einer Antisense-RNA (die spezifisch die Synthese eines Zielproteins verhindert) in das Onkogen, das zur Bildung von Tumorzellen ausgelöst wird. Eine andere Methode heißt „Suicide Gene therapy“, die Gene einführt, um Krebszellen selektiv abzutöten., Viele genetische Codes für toxische Proteine und Enzyme sind bekannt, und die Einführung dieser Gene in Tumorzellen würde zum Zelltod führen. Die Schwierigkeit bei dieser Methode besteht darin, ein sehr präzises Abgabesystem sicherzustellen, um das Abtöten gesunder Zellen zu verhindern.
Diese Methoden werden durch Sequenzierung zur Analyse von Tumorgenomen ermöglicht, sodass medizinische Experten die Chemotherapie und andere Krebsbehandlungen effektiver auf die einzigartige genetische Zusammensetzung ihrer Patienten abstimmen und die diagnostischen Stadien der personalisierten Medizin revolutionieren können.,

Wenn die Kosten für die DNA-Sequenzierung sinken, wird sie weiter verbreitet, was eine Reihe von Problemen mit sich bringt. Sequenzierung erzeugt große Datenmengen, und es gibt viele rechnerische Herausforderungen mit der Verarbeitung und Speicherung der Daten verbunden. Es gibt auch ethische Fragen, wie das Eigentum an der DNA eines Individuums, wenn die DNA sequenziert wird. DNA-Sequenzierungsdaten müssen sicher gespeichert werden, da Bedenken bestehen, dass Versicherungsgruppen, Hypothekenmakler und Arbeitgeber diese Daten verwenden können, um Versicherungsangebote zu ändern oder zwischen Kandidaten zu unterscheiden., Die Sequenzierung kann auch helfen, herauszufinden, ob eine Person ein erhöhtes Risiko für eine bestimmte Krankheit hat, aber ob der Patient informiert ist oder ob es eine Heilung für die Krankheit gibt, ist ein ganz anderes Problem.

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Siehe auch

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