Viele biologische Anwendungen wie Mikrobiologie, Zellkultur, Blutarbeit und viele andere, die Zellen verwenden, erfordern, dass wir die Zellkonzentration für unser Experiment bestimmen.

Die Zellzählung ist ziemlich einfach und erfordert eine Zählkammer namens Hämozytometer, ein Gerät, das vom französischen Anatomen Louis-Charles Malassez aus dem 19. Ein Hämozytometer besteht aus einem dicken Glasmikroskopschieber mit einem Gitter aus senkrechten Linien, die in der Mitte geätzt sind., Das Gitter hat Abmessungen angegeben, so dass der von den Linien bedeckte Bereich bekannt ist, wodurch die Anzahl der Zellen in einem bestimmten Lösungsvolumen gezählt werden kann.

Abbildung 1. Ein klassisches Hämozytometer

Der gebräuchlichste Hämozytometertyp hat in der Mitte eine“ H “ -Form, die zwei separate spiegelartig polierte Rasterflächen umschließt und den Abdeckungs-und Montagebereich bietet (Abbildung 1).,

Laden des Hämozytometers

Stellen Sie vor dem Start sicher, dass sowohl das Hämozytometer als auch sein Coverslip sauber sind, indem Sie Staubpartikel mit Linsenpapier entfernen. Deckgläser, die für die Montage auf Hämozytometern verwendet werden, sind speziell dicker als die herkömmlichen Mikroskopie-Deckgläser, da sie in der Lage sein müssen, die Oberflächenspannung eines Flüssigkeitstropfens zu überwinden.

Stellen Sie vor dem Laden der Zellensuspension sicher, dass Sie zuerst den Coverslip über die Zählfläche legen., Legen Sie dann die Pipettenspitze mit Ihrer Probe in einen der V-förmigen Vertiefungen, wie in Abbildung 2, und führen Sie die Probe vorsichtig aus. Der Bereich unter dem Coverslip füllt sich durch Kapillarwirkung. Es sollte genügend Flüssigkeit eingebracht werden, damit die gespiegelte Oberfläche gerade bedeckt ist, normalerweise um 10 µl, aber die Oberfläche nicht überfüllen. Sie können zwei Proben auf ein Hämozytometer laden,eine in jedes der beiden Gitter.

Abbildung 2., Beladung des Hämozytometers

Das beladene Hämozytometer wird dann auf die Mikroskopstufe gesetzt und das Zählgitter bei geringer Leistung in den Fokus gerückt. Lassen Sie die Probe einige Minuten ruhen und vermeiden Sie es, die Abdeckung zu bewegen, da dies zu Luftblasen führen und das Zählen erschweren kann.

Zellen in einem Hämozytometer zählen

Das vollständige Gitter auf einem Hämozytometer enthält neun Quadrate, von denen jedes 1 mm2 beträgt (Abbildung 3). Der zentrale Zählbereich des Hämozytometers (Abbildung 3B) enthält 25 große Quadrate und jedes große Quadrat hat 16 kleinere Quadrate., Zählen Sie beim Zählen nur die Zellen auf den Linien von zwei Seiten des großen Quadrats, um zu vermeiden, dass Zellen zweimal gezählt werden (Abbildung 3G). Suspensionen sollten so verdünnt sein, dass sich die Zellen oder andere Partikel nicht auf dem Gitter überlappen und gleichmäßig verteilt sein sollten.

Abbildung 3. Zählen von Zellen auf dem Hämozytometer.

Um zwischen toten und lebensfähigen Zellen zu unterscheiden, wird die Probe häufig mit einem bestimmten Fleck wie Trypanblau verdünnt., Diese Färbemethode, auch als Farbstoffausschlussfärbung bekannt, verwendet einen Diazofarbstoff, der selektiv in Zellmembranen toter Zellen eindringt und diese blau färbt, während er nicht von Membranen lebender Zellen absorbiert wird, wodurch lebende Zellen von der Färbung ausgeschlossen werden. Bei Betrachtung unter dem Mikroskop erscheinen tote Zellen als dunkelblau (Abbildung 4)

Abbildung 4. Trypan Blue Ausschluss lebender Zellen auf dem Hämozytometer. (Pfeil zeigt die Aufnahme von Farbstoff über die Membran von toten Zellen.,)

Um die Zählung durchzuführen, bestimmen Sie die Vergrößerung, die erforderlich ist, um den gewünschten Zelltyp zu erkennen, und zählen Sie systematisch die Zellen in ausgewählten Quadraten, so dass die Gesamtzahl ungefähr 100 Zellen beträgt, eine minimale Anzahl von Zellen, die für eine statistisch signifikante Zählung benötigt werden.

Bei großen Zellen können Sie einfach die Zellen innerhalb der vier großen Eckquadrate (Abbildung 3C-F) und der mittleren (Abbildung 3B) zählen. Für eine dichte Suspension kleiner Zellen möchten Sie möglicherweise die Zellen in den vier äußeren und mittleren Quadraten des zentralen Quadrats zählen (Abbildung 3B) oder eine verdünntere Suspension herstellen.,

Denken Sie daran, wenn eine Zelle ein Urteil überlappt, zählen Sie es als „in“, wenn es das obere oder rechte Urteil überlappt, und“ out“, wenn es das untere oder linke Urteil überlappt (Abbildung 3G).

Die Fläche der Mitte (Abbildung 3B) und jedes Eckquadrats (Abbildung 3C-F) beträgt 1 mm x 1 mm = 1 mm2: Die Tiefe jedes Quadrats beträgt 0,1 mm. Das Endvolumen jedes Quadrats in dieser Tiefe beträgt 100nl.,

Sobald Sie die gesamte Zellzahl erhalten haben, kann die Zellkonzentration aus der folgenden Formel berechnet werden:

Wenn Sie beispielsweise Ihre Probe 1:1 mit Trypanblau verdünnt haben und 325 Zellen in 4 Eckquadraten plus dem zentralen großen Quadrat gezählt haben, ist die Gesamtzahl der Zellen pro ml =

Wenn Sie wissen möchten, wie viele Zellen Sie in Ihrer Originalprobe haben, multiplizieren Sie einfach die Zellkonzentration mit dem Gesamtprobenvolumen. Wenn Ihr ursprüngliches Probenvolumen beispielsweise 5 ml beträgt, hat Ihre Probe insgesamt =