nauwkeurige genoomreplicatie is van cruciaal belang voor de levensvatbaarheid van elk organisme. Het algemene concept voor het kopiëren van DNA was duidelijk op de opheldering van de dubbele spiraalvormige structuur van DNA en de identificatie van basispaar complementariteit (1): één bundel nucleobases kon als malplaatje voor synthese van een nieuwe bundel dienen. Binnen een decennium van deze ontdekkingen, werd een agent gezuiverd van E. coli die DNA bundel duplicatie (2) katalyseerde. Dit middel werd een “polymerase”genoemd. E., coli de Polymerase I van DNA, de eerste ontdekte polymerase van DNA was niet de primaire replicatieve polymerase, maar in plaats daarvan één betrokken bij de resolutie van het achterblijvende bundel Okazaki fragment en de reparatie van DNA. Dit voorspelde toekomstige ontdekkingen van vele polymerasefamilies van DNA, die elk specifieke cellulaire vereisten voor de replicatie en de reparatie van DNA dienen.

DNA-polymerasen dienen als fundamentele enzymen in de biowetenschappen om dezelfde reden dat ze kritisch van aard zijn: ze kopiëren DNA. De polymerasetoepassingen omvatten het etiketteren van DNA, het rangschikken en versterking., Één specifiek versterkingsprotocol, is de polymerasekettingreactie (PCR) een wijd gebruikte techniek die thermofiele polymerases aanwendt om specifieke segmenten van DNA (3) exponentieel te versterken en een waaier van toepassingen van menselijke en pathogendiagnostiek aan het moleculaire klonen in biologielaboratoria rond de wereld toelaat.

Polymerasenauwkeurigheid

PCR stelt dezelfde basiseisen aan een polymerase als een cel aan zijn replicatiesysteem stelt. In wezen moet de polymerase betrouwbaar, nauwkeurig en snel zijn., Polymerasenauwkeurigheid of” trouw ” verwijst naar de neiging om het juiste nucleotide op te nemen zoals gespecificeerd door de template streng. De standaard PCR enzymen zijn, niet verrassend, vrij nauwkeurig. Zelfs Thermus aquaticus (Taq) DNA-polymerase, beschouwd als een lage getrouwheid PCR-polymerase, maakt slechts een fout eenmaal in ongeveer nucleotide-inserties (12)., Polymerase ontdekking en engineering inspanningen hebben high-fidelity polymerases geproduceerd, die zelden maken Base substitutie fouten, die DNA sequencing methoden om miljoenen gesynthetiseerde basen te lezen om fouten te detecteren door de polymerase vooruitgang in het meten van fidelity door single-molecule sequencing heeft geïdentificeerd Q5® High-Fidelity DNA Polymerase als het hebben van fidelity 280X greater thanTaq DNA polymerase (12).,

Fidelity checkpoints: geometrische selectie op de actieve plaats en verder

DNA-polymerasen zorgen voor een nauwkeurige replicatie met behulp van een reeks moleculaire checkpoints, op de plaats waar nucleotide wordt opgenomen en verder (1). Tijdens nucleotide-toevoeging, wordt het correcte inkomende nucleotide gepositioneerd voor een productieve aanpassing van katalytische groepen, die efficiënte integratie verzekeren. Deze uitlijning voor katalyse is gevoelig voor vervormingen in positie veroorzaakt door onjuiste Watson-Crick base pairing, waardoor kinetische afslaan bij onjuiste of niet-verwante basenparen mogelijk is.,

proeflezen van DNA-polymerasen

een andere methode om de betrouwbaarheid te verhogen is dat de polymerase 3→5 exonucleaseactiviteit heeft, “proeflezen”genoemd. Met behulp van de base-pairing en actieve site moleculaire checkpoints hierboven beschreven, Taq DNA polymerase is ongelooflijk nauwkeurig, maar proeflezen enzymen kunnen nog hogere betrouwbaarheid hebben. Deze extra nauwkeurigheid wordt overgebracht via het proeflezen, met de polymerase “controleren” of de juiste nucleotide in het malplaatje is ingevoegd., Als een mismatch wordt ontdekt wordt het DNA overgebracht van het polymerisatiedomein naar een n-terminal 3→5 exonuclease domein van de polymerase. Het incorrect opgenomen nucleotide wordt uitgesneden, beweegt DNA terug in het polymerisatiedomein, en het kopiëren kan (Figuur 2) hervatten.

bacteriofaag T4 bleek een nuttig experimenteel systeem te zijn voor het evalueren van het belang van 3→5 exonuclease activiteit voor nauwkeurige DNA replicatie (6). Mutaties in T4 gen 43 (dat codeert voor de DNA-polymerase) werden geïdentificeerd die ofwel verminderde of verhoogde trouw. Door het definiëren van een exonuclease/polymerase (N/P) activiteitsratio voor een mutantenzym werd gevonden dat polymerasen met lage N/P ratio ’s meer foutgevoelig waren dan die met hoge N/P ratio’ s., Een verklaring voor deze observatie is dat bij inbouw van een mismatched base het waarschijnlijker is dat de exonuclease het nucleotide zal verwijderen alvorens de polymeraseactiviteit het in enzymen met hogere N/P verhoudingen uitbreidt. Interessant is dat de proeflezen effectiviteit van een polymerase sequentieafhankelijkheid kan vertonen. Bijvoorbeeld, zijn At-rijke opeenvolgingen effectiever proefgelezen dan GC-gebieden. Deze discrepantie wordt verondersteld te zijn te wijten aan de lagere stabiliteit van AT-regio ‘ s die het smelten van strengen en dus proeflezen activiteit vergemakkelijkt.,

de afwezigheid van 3→5 exonucleaseactiviteit kan andere vertakkingen hebben dan trouw in PCR. Het gebrek aan proeflezen activiteit in Taq DNA Polymerase is voorgesteld om de amplicongrootte mogelijk te beperken met dit enzym (7). Over het algemeen presteert Taq het beste bij het amplificeren van DNA-fragmenten < 2 kb, en kan werken met fragmenten tot 3-4 kb. Wanneer het aan deze amplicongrootte wordt gehouden, is Taq een robuust, gemakkelijk geoptimaliseerd enzym. Echter, boven ~3 kb daalt het snel in effectiviteit., Tijdens PCR, zal Taq nucleotiden misincorporeren en mismatches veroorzaken, waarbij het naar voren gebogen aan het rekken is en waarschijnlijker zal dissociëren alvorens zich in vergelijking met correct basis in paren gerangschikt 3 einden uit te breiden. Daarom kunnen bij een bepaalde amplicongrootte en polymerasefoutpercentage genoeg mismatched 3 einden accumuleren om het PCR-proces effectief te remmen. Deze niet-overeenkomende 3 uiteinden zijn bijzonder problematisch voor Taq omdat het de 3→5 exonuclease activiteit mist om ze te verwijderen., Door toevoeging van een kleine hoeveelheid proeflezen enzym zoals Deep Vent®DNA Polymerase, kan amplificatie van fragmenten ≥ 20 kb worden bereikt (Figuur 3). Aangezien de overgrote meerderheid van het enzym in het mengsel Taq DNA-Polymerase is, doet het waarschijnlijk het grootste deel van de primeruitbreiding, waarbij de proofreading Deep Vent polymerase de remmende 3 mismatches verwijdert die door Taq worden gegenereerd.,

Polymeraseprocessiviteit

Het belang van proeflezen voor PCR is al bijna twee decennia algemeen bekend, maar een andere eigenschap, processiviteit, heeft meer aandacht gekregen., “Processiviteit” is een term die verwijst naar het aantal nucleotiden dat door een polymerase in een enkele bindende gebeurtenis (vóór dissociatie) is opgenomen. De polymerase van Taq DNA voegt ongeveer 50 nucleotiden per bindende gebeurtenis toe (8). Waarom is dit belangrijk? Een laag-processivity of” distributieve ” polymerase breidt een populatie van sjablonen op een merkbaar andere manier uit dan een processieve polymerase. Een hoogst distributieve polymerase bindt aan een malplaatje, voegt een paar nucleotiden toe, en scheidt, verlatend een bevolking van malplaatjes die gelijk met tijd kan worden uitgebreid., Een hoogst processieve polymerase bindt een malplaatje en breidt zich met langere bindende gebeurtenissen uit.

Het zou volgen dat na voldoende tijd het resultaat van een processieve of distributieve polymerasereactie een populatie van gekopieerde sjablonen zou zijn. In bepaalde omstandigheden is het echter mogelijk dat de processieve polymerase superieure prestaties heeft. De subeenheid E. coli-polymerase III α, die deel uitmaakt van de belangrijkste replicatieve polymerase, heeft een processiviteit van < 10 basenparen en een snelheid van < 20 nucleotiden/seconde (nt/s)., Echter, wanneer de subeenheid associeert met de andere replisome subeenheden, met name de glijklem, stijgen de effectieve processiviteit en replicatiesnelheid tot > 50 kb en 1.000 nt/s, respectievelijk (9). De term “effectieve processiviteit” wordt gebruikt omdat er gegevens zijn die aangeven dat de polymerasesubeenheid in het replisoom kan worden uitgewisseld, maar het replisoom behoudt een snelle, processieve DNA-replicatie (10).

om te profiteren van processiviteit in PCR hebben onderzoekers een DNA-bindingsdomein gefuseerd met een archaeale polymerase (11)., Dit chimerische enzym heeft verscheidene verbeterde eigenschappen, maar met name het is in staat om DNA met kortere uitbreidingstijden te versterken en langere DNA-producten efficiënter te produceren, waardoor de Algemene thermocyclingtijden worden verkort. Dit fusieidee is de basis van Q5 high-Fidelity DNA-Polymerase en Phusion ® High-Fidelity DNA-Polymerase, twee polymerasen die beschikbaar zijn via NEB (Figuur 4).

toekomstige richtingen

veel eigenschappen beïnvloeden de werkzaamheid en het nut van een PCR-polymerase. Polymerase actieve site architectuur en proeflezen activiteit beïnvloeden de nauwkeurigheid van het eindproduct. De polymerasemengsels en de fusie aan een bindende proteã ne van DNA verlenen superieure PCR prestaties voor ampliconlengte en, in het geval van chimera, reactiesnelheid., Andere belangrijke vooruitgang in PCR, zoals heet-beginpolymerases om reactiespecificiteit, multiplex PCR (Figuur 5) en qPCR te verhogen hebben ook de het levenswetenschappen een revolutie teweeggebracht.

zoals aangetoond door geconstrueerde mengsels en chimera ‘ s, kunnen de eigenschappen van de polymerase zelf worden gemoduleerd om de PCR-prestaties te verbeteren. In de toekomst, is het waarschijnlijk dat de polymeraseeigenschappen in toenemende mate aan specifieke PCR-toepassingen zullen worden aangepast, en als zodanig, is dit een belangrijk gebied van onderzoek bij NEB.,

Bekijk het DNA-Polymeraseselectieschema van de NEB