veel biologische toepassingen zoals microbiologie, celkweek, bloedonderzoek en vele andere die cellen gebruiken, vereisen dat we de celconcentratie voor ons experiment bepalen.

Het tellen van cellen is vrij eenvoudig en vereist een telkamer genaamd een hemocytometer, een apparaat uitgevonden door de 19e-eeuwse Franse anatoom Louis-Charles Malassez om bloedceltellingen uit te voeren. Een hemocytometer bestaat uit een dikke glazen microscoop dia met een raster van loodrechte lijnen geëtst in het midden., Het raster heeft afmetingen gespecificeerd zodat het gebied dat door de lijnen wordt bestreken bekend is, waardoor het mogelijk is om het aantal cellen in een specifiek volume oplossing te tellen.

figuur 1. Een klassieke Hemocytometer

het meest voorkomende type hemocytometer heeft een in het midden gegraveerde” H ” -vorm die twee afzonderlijke spiegelachtige gepolijste roostervlakken omsluit en de afdekslipbevestigingszone vormt (figuur 1).,

het laden van de hemocytometer

voordat u begint zorg ervoor dat zowel de hemocytometer als de coverslip schoon zijn door eventuele stofdeeltjes met lenspapier te verwijderen. Coverslips die worden gebruikt voor montage op hemocytometers zijn speciaal gemaakt om dikker te zijn dan de conventionele microscopie coverslips omdat ze in staat moeten zijn om de oppervlaktespanning van een druppel vloeistof te overwinnen.

zorg ervoor dat u eerst de coverslip over het teloppervlak plaatst voordat u de celsuspensie laadt., Plaats vervolgens de punt van de pipet met uw monster in een van de V-vormige putjes, zoals in Figuur 2, en verwijder het monster voorzichtig. Het gebied onder de dekslip vult door capillaire werking. Voldoende vloeistof moet worden ingevoerd, zodat het gespiegelde oppervlak is net bedekt, meestal rond 10 µl, maar niet overvullen het oppervlak. Je kunt twee monsters laden op één hemocytometer, één in elk van de twee rasters.

Figuur 2., Het laden van de Hemocytometer

de geladen hemocytometer wordt vervolgens op het microscoopstadium geplaatst en het telrooster wordt bij laag vermogen in beeld gebracht. Laat het monster zich een paar minuten settelen en vermijd het verplaatsen van de dekslip omdat het luchtbellen kan introduceren en het tellen moeilijk kan maken.

cellen tellen in een hemocytometer

het volledige raster op een hemocytometer bevat negen kwadraten, die elk 1 mm2 bedragen (Figuur 3). Het centrale telgebied van de hemocytometer (figuur 3B) bevat 25 Grote vierkantjes en elk groot vierkant heeft 16 kleinere vierkantjes., Tel bij het tellen alleen die cellen op de lijnen van twee zijden van het grote vierkant om te voorkomen dat cellen tweemaal worden geteld (figuur 3G). Suspensies moeten verdund genoeg zijn, zodat de cellen of andere deeltjes elkaar niet overlappen op het rooster, en moeten gelijkmatig worden verdeeld.

Figuur 3. Cellen tellen op de Hemocytometer.

om onderscheid te maken tussen dode en levensvatbare cellen, wordt het monster vaak verdund met een bepaalde vlek, zoals Trypan blue., Deze het bevlekken methode, ook als kleurstofuitsluiting het bevlekken wordt bekend, gebruikt een diazo kleurstof die selectief celmembranen van dode cellen doordringt, die hen blauw kleuren, terwijl het niet door membranen van levende cellen wordt geabsorbeerd, waarbij levende cellen van het bevlekken worden uitgesloten. Onder een microscoop zouden dode cellen donkerblauw lijken (Figuur 4)

Figuur 4. Trypan Blue uitsluiting van levende cellen op de Hemocytometer. (Pijl geeft opname van kleurstof over het membraan van dode cellen.,)

om de telling uit te voeren, bepaalt u de vergroting die nodig is om het gewenste celtype te herkennen en telt u systematisch de cellen in geselecteerde vierkanten zodat de totale telling ongeveer 100 cellen bedraagt, een minimum aantal cellen dat nodig is voor een statistisch significante telling.

voor grote cellen kunt u eenvoudig de cellen tellen in de vier grote hoekvierkantjes (figuur 3C-F) en de middelste (figuur 3B). Voor een dichte suspensie van kleine cellen kunt u de cellen in de vier buitenste en middelste vierkanten van het centrale vierkant tellen (figuur 3B) of een meer verdunde suspensie maken.,

onthoud als een cel een regel overlapt, tel het als ” in “als het de bovenste of rechter regel overlapt, en” out ” als het de onderste of linker regel overlapt (figuur 3G).

De oppervlakte van het midden (figuur 3B) en elk hoekvierkant (figuur 3C-F) is 1 mm x 1 mm = 1 mm2: de diepte van elk vierkant is 0,1 mm. het uiteindelijke volume van elk vierkant op die diepte is 100nl.,

als je Eenmaal hebt verkregen van het totaal aantal cellen, cel concentratie kan worden berekend uit de volgende formule:

Dus, bijvoorbeeld, als u verdunde monster 1:1 met Trypan blue, en je telde 325 cellen in 4 hoek pleinen plus het grote centrale plein, totaal cellen per ml =

Als u wilt weten hoeveel cellen u in uw oorspronkelijke steekproef, vermenigvuldigt u gewoon de cel concentratie door de totale steekproef volume. Bijvoorbeeld, als uw oorspronkelijke monstervolume 5 ml is, dan heeft uw monster een totaal =