wiele zastosowań biologicznych, takich jak Mikrobiologia, hodowla komórek, badania krwi i wiele innych, które wykorzystują komórki, wymaga określenia stężenia komórek w naszym eksperymencie.

liczenie komórek jest dość proste i wymaga Komory liczenia zwanej hemocytometrem, urządzenia wynalezionego przez XIX-wiecznego francuskiego anatoma Louisa-Charlesa Malasseza do wykonywania morfologii krwi. Hemocytometr składa się z grubego szkiełka mikroskopowego z siatką prostopadłych linii wytrawionych w środku., Siatka ma określone wymiary tak, że obszar objęty liniami jest znany, co umożliwia zliczenie liczby komórek w określonej objętości roztworu.

Rysunek 1. Klasyczny Hemocytometr

najczęstszy typ hemocytometru ma wygrawerowany na środku kształt litery „H”, który obejmuje dwie oddzielne, lustrzane polerowane powierzchnie siatki i zapewnia obszar mocowania pokrywy (ryc. 1).,

Ładowanie hemocytometru

przed uruchomieniem upewnij się, że zarówno hemocytometr, jak i jego coverslip są czyste, usuwając wszelkie cząsteczki kurzu papierem soczewkowym. Coverslips, które są używane do montażu na hemocytometrach są specjalnie wykonane, aby być grubsze niż konwencjonalne mikroskopii coverslips, ponieważ muszą być w stanie przezwyciężyć napięcie powierzchniowe kropli cieczy.

upewnij się, że najpierw umieścisz coverslip na powierzchni liczenia przed załadowaniem zawieszenia komórki., Następnie umieścić końcówkę pipety wraz z próbką w jednej ze studni w kształcie litery V, jak na rysunku 2, i delikatnie wydalić próbkę. Obszar pod coverslip wypełnia działanie kapilarne. Należy wprowadzić wystarczającą ilość płynu, aby lustrzana powierzchnia była tylko pokryta, zwykle około 10 µl, ale nie przepełniała powierzchni. Możesz załadować dwie próbki na jeden hemocytometr, po jednej do każdej z dwóch siatek.

Rysunek 2., Ładowanie Hemocytometru

załadowany hemocytometr jest następnie umieszczany na etapie mikroskopu, a siatka zliczająca jest ustawiana na ostrość przy małej mocy. Pozostawić próbkę na kilka minut i unikaj przesuwania coverslip, ponieważ może to wprowadzić pęcherzyki powietrza i utrudnić liczenie.

liczenie komórek w hemocytometrze

pełna siatka na hemocytometrze zawiera dziewięć kwadratów, z których każdy ma 1 mm2 (ryc. 3). Centralny obszar liczenia hemocytometru (rysunek 3B) zawiera 25 dużych kwadratów, a każdy duży kwadrat ma 16 mniejszych kwadratów., Podczas liczenia policz tylko te komórki na liniach dwóch stron dużego kwadratu, aby uniknąć podwójnego liczenia komórek (rysunek 3G). Zawiesiny powinny być wystarczająco rozcieńczone, aby komórki lub inne cząstki nie nakładały się na siebie na siatce i powinny być równomiernie rozmieszczone.

Rysunek 3. Liczenie komórek na Hemocytometrze.

aby odróżnić martwe i żywotne komórki, próbka jest często rozcieńczana określoną plamą, np. błękitem Trypanowym., Ta metoda barwienia, znana również jako barwienie wykluczające barwnik, wykorzystuje barwnik diazo, który selektywnie przenika przez błony komórkowe martwych komórek, barwiąc je na niebiesko, podczas gdy nie jest wchłaniany przez błony żywych komórek, wykluczając w ten sposób żywe komórki z barwienia. Po obejrzeniu pod mikroskopem martwe komórki pojawią się jako ciemnoniebieskie (Rysunek 4)

Rysunek 4. Niebieski Trypan wykluczenie żywych komórek na Hemocytometrze. (Strzałka wskazuje wychwyt barwnika przez błonę martwych komórek.,)

aby wykonać zliczanie, należy określić powiększenie potrzebne do rozpoznania pożądanego typu komórki i systematycznie policzyć komórki w wybranych kwadratach tak, aby całkowita liczba wynosiła około 100 komórek, czyli minimalną liczbę komórek potrzebną do statystycznie istotnej liczby.

w przypadku dużych komórek można po prostu policzyć komórki wewnątrz czterech dużych kwadratów narożnych (rysunek 3C-F) i środkowego (rysunek 3B). W przypadku gęstej zawiesiny małych komórek można policzyć komórki w czterech zewnętrznych i środkowych kwadratach centralnego kwadratu (rysunek 3B) lub zrobić bardziej rozcieńczoną zawiesinę.,

pamiętaj, jeśli komórka nakłada się na regułę, policz ją jako „W”, jeśli nakłada się na górną lub prawą regułę, i „out”, jeśli nakłada się na dolną lub lewą regułę (rysunek 3G).

powierzchnia środka (ryc. 3b) i każdego kwadratu narożnego (ryc. 3C-F) wynosi 1 mm x 1 mm = 1 mm2: głębokość każdego kwadratu wynosi 0,1 mm. końcowa objętość każdego kwadratu na tej głębokości wynosi 100nl.,

Po uzyskaniu całkowitej liczby komórek stężenie komórek można obliczyć z następującego wzoru:

Tak więc, na przykład, jeśli rozcieńczyłeś próbkę 1:1 błękitem Trypanowym i policzyłeś 325 komórek w 4 narożnych kwadratach plus centralny duży kwadrat, całkowita liczba komórek na ml =

Jeśli chcesz wiedzieć, ile komórek masz w oryginalnej próbce, po prostu pomnóż stężenie komórek przez całkowitą objętość próbki. Na przykład, jeśli oryginalna objętość próbki wynosi 5 ml, próbka ma całkowitą wartość =