růst Rostlin

Semena rajčat CM (Castlemart, divoký typ) byly vyklíčila a pěstovány v růstové komoře pod 18 h světla na 27 °C a 6 hodin tmy při 18 °C v hydroponii nebo substrátu kultury. Rostliny se zdravými rozšířil pravé listy jsou sklizeny pro přípravu GCPs (Další soubor 1: Obr. S1 a Obr. 1)., Epidermální fragmenty pravých listů byly shromážděny, jak je popsáno pro metodu L nebo metodu s.

Stráž buňky v různých fázích enzymatické trávení v Metodě L (a–c) a Metoda S (d–l). A-f sedm plně rozšířených listů hydroponických rostlin vybraných pro izolaci GCPs (další soubor 1: obr. S1). G-I sedm plně rozšířených listů rostlin substrátové kultury vybraných pro izolaci GCPs., J-l čtyři plně rozšířené listy hydroponických rostlin (mladší rostliny ve srovnání s d–f) vybrané pro izolaci GCPs. a, d, h, K stav GCs po 1,5, 0,5, 2 a 0,5 h trávení v roztoku enzymu 1. B, E stav GCs po 2 a 1 h trávení v enzymatickém roztoku 2. c, f, i, l stav GCS po 3,5, 2,5, 4,5 a 1,5 h trávení v enzymatickém roztoku 2. Měřítko bary naznačují, 20 µm,

Příprava GCPs: Metoda L

plně rozšířena pravé listy (vážil ~ 10 g), které byly sklizeny z hydroponické rostliny rajčete., Poté byly listy smíchány po dobu 1 minuty (tři impulsy po 20 s) v mixéru (18 000 ot/min) ve 250 ml studené destilované vody. Smíšené listový směs se nalije přes 74-µm nylon mesh odstranit rozbité mesophyll cells a několikrát propláchnout studenou destilovanou vodou, dokud většina z pěny vyráběné smícháním měl do značné míry zmizel a epidermální fragmenty byly světle zelené. Pak, epidermální tkáně byly převedeny do baňky obsahující 50 ml roztoku enzymu 1, která byla inkubována 1,5 h při 27 °C v třepací vodní lázni, ve tmě, s třesoucí se nastavená rychlost až 100 ot / min., Po 1,5 h inkubace byly epidermální fragmenty shromážděny na 58 µm nylonové síťce, jemně opláchnuty základním médiem 2 a přeneseny do 50 ml enzymatického roztoku 2 v baňce. Toto řešení obsahující fragmenty byly poté inkubovány při 25 °C v třepací vodní lázni (70 ot. / min), dokud většina GCPs byli propuštěni, obvykle po cca 3,5 h. Zlepšit uvolnění GCPs z epidermální peeling, baňky byl vířil jemně v ruce na několik sekund na konci trávení., Kromě toho, peeling v enzymový roztok byl opatrně prošel několikrát přes pipetor vybaven 5-ml tip, který byl řez k uvolnění GCPs. Enzymolýzový účinek byl hodnocen pod mikroskopem. Druhá směs pro trávení enzymu byla filtrována přes 37-µm nylonovou síť. Epidermální tkáně na síti byly opláchnuty základním médiem 2, aby se dále uvolnily GCPs. Enzymový roztok obsahující protoplasty byl poté filtrován přes 15-µm nylonovou síť a uvolněné GCP byly odebrány (v 50-ml odstředivkových zkumavkách) centrifugací po dobu 6 minut při 300×g., GCPs byly třikrát promyty základním médiem 2, aby se GCPs udržely bez pelet smíšených buněk a jiných nečistot. Po odstranění supernatantu byl získán objem 5 ml protoplastů, který byl uložen při 4 °C ve tmě pro další čištění nebo pro jiné experimenty.

Příprava GCPs: metoda s

Tento protokol byl odvozen z „metody L“, s jednou modifikací zahrnující složení enzymatického roztoku 1. Enzymový roztok 1 se skládá z 1,0% (w/v) celulózy „Onozuka“ RS, 0,01% (w/v) Pektolyázy Y-23, 0,1% (w/v) PVP-40, 0,25% (w/v) hovězí sérový albumin a 0.,5 mM l-Kyselina askorbová, rozpuštěná v základním médiu 1. Zlepšení metody S snížilo čas potřebný o 2 h ve srovnání s metodou L. první enzymové trávení potřebuje pouze 0,5 h, zatímco druhé enzymové trávení potřebuje 2,5 h a 1,5 h (u mladých rostlin Obr. 1).

Čištění GCPs

odstranit fragmenty z cévní tkáně a nečistoty z GCPs, další purifikační krok byl proveden, který výrazně zlepšuje čistotu GCPs., Protokol o čištění GCPs byl podle protokolu předchozích metod, přičemž zde byly popsány modifikace upravené pro rajčata. K suspenzi GCPs byl přidán základní roztok 2, aby se dosáhlo konečného objemu 8 ml. Šest mililitrů Histopaque (č. 1077, Sigma-Aldrich) bylo pečlivě pipetováno do dna odstředivkové trubice. GCP byly poté pečlivě vrstveny na vrcholu Histopaque. Zkumavky byly odstředěny po dobu 20 minut při 150×g, poté byly GCPs odebrány z rozhraní obou roztoků Pasteurovou pipetou a přeneseny do nové zkumavky., Na GCPs byly ředěny základní řešení 2, a pak trubky byly odstředěny po dobu 6 min při 300×g. Supernatant byl odstraněn, a izolované GCPs byly resuspendovány v 1 ml základního roztoku 2 a uchovávány na ledu ve tmě až následné testy.

Hodnocení protoplast životaschopnost

životaschopnost GCPs byl hodnocen pomocí měření fluorescence s fluorescein diacetát (FDA). Hydrolýza barviva byla pozorována po smíchání GCPs s inkubační směsí po dobu 5 minut. Provozní koncentrace FDA byla 0,01% (w/v) rozpuštěna v acetonu., Přípravky Protoplast byly prohlíženy a zobrazovány pomocí fluorescenčního mikroskopu Zeiss Axio Observer D1 s modrou excitací pomocí kombinace filtrů FITC.

Příprava MCPs

metoda izolace Solanum lycopersicum je modifikována od metody popsané Romano et al. . Plně rozšířené listy jsou nakrájeny na 0,5 cm2 kusů. List kusy jsou pak přenesena do 30 ml roztoku enzymu: 5 mM Mes, 0,65 M D-mannitolu, 1 mM CaCl2, 0,5% a (w: v) Macerozyme R-10 (Yakult, Japonsko), 1% (w: v) Celuláza R-10 (Yakult, Japonsko), je 0,25% (w: v) BSA a 0,1% (w: v) PVP-40, pH 5,5 (KOH)., Trávení se provádí při 25 °C po dobu 2 hodin s pomalým třepáním (40 exkurzí za minutu) ve vodní lázni. Enzymový roztok se po jemném vířícím pohybu změní na zelenou, což naznačuje uvolnění protoplastů. Doba trávení závisí na experimentálních cílech a použitých materiálech. Není nutné uvolňovat všechny protoplasty z listových kusů. Roztok se přefiltruje přes 37 µm nylonovou síť do 50 ml odstředivkové zkumavky. Zachované listové kousky se opláchnou 20 ml inkubačního média (0,65 M D-mannitol, 1 mM CaCl2) a také se shromáždí filtrát., Vydané vícečipové integrované obvody byly získány centrifugací po dobu 5 min při 100×g. Pelet byl promyt třikrát s 0,65 M D-mannitolu obsahující 1 mM CaCl2. Izolované MCP byly uloženy na ledu ve tmě až do použití.

Semi-kvantitativní reverzní transkripce PCR analýzy

Celková RNA byla extrahována z GCPs a mesophyll cell protoplasts (Mcp) pomocí Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Kat. č. 12204-01, USA) podle pokynů výrobce v protokolu., Celková RNA byla reverzně přepisována do cDNA pomocí super-skriptovacího systému syntézy prvního řetězce (TransGen Biotech) podle pokynů výrobce. Semi-kvantitativní RT-PCR byla provedena s dvěma geny, které byly konkrétně vyjádřeny ve stráži buňky nebo mesophyll cells posoudit protoplast čistoty. Actin Gen (forward primer, 5 ‚- CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′; reverzní primer, 5′-TCACCAGTCCAACACAA TAC-3‘) byl použit jako kontrola pro experimenty RT-PCR., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

Kvantitativní real-time PCR (zásahovou jednotku-PCR) analýzy

zásahovou jednotku-PCR byla provedena s čtyři geny, které byly přednostně vyjádřeny v stráž buňky nebo líčen jako regulátory ABA odpověď a ukázal přepis úrovni, indukce a represe v reakci na MeJA ve stráži buněk. GCPs suspenze inkubována v microfuge 1,5 ml zkumavkách při pokojové teplotě po dobu 10 min, a pak se zpracuje s 50 µM ± MeJA (konečná koncentrace), pro 5, 10, 15, 20 min. Po inkubaci byly strážní buňky shromažďovány současně, zmrazeny a skladovány při − 80 °C až do další analýzy., Vzhledem k tomu, že protoplasting indukuje expresi stresu-související geny, dva různé transkripční inhibitory, aktinomycin D (33 mg/L) a cordycepin (100 mg/L), byly použity všechny postupy izolace, včetně první krok mísení . Byly provedeny qRT-PCR analýzy exprese genů s časnou odpovědí na rány s inhibitory transkripce nebo bez nich.

celková RNA byla izolována z Gcps pomocí izolační sady Arcturus PicoPure RNA (Applied Biosystems, Cat č. 12204-01, USA) podle protokolu výrobce., Všechny vzorky RNA byly tráveny Dnázou bez Rnázy, aby se odstranila genomická DNA. Kvalita a koncentrace každého ze vzorků RNA byla stanovena pomocí spektrofotometru Namedrop 2000 (Thermo Scientific). Integrita RNA byla také kontrolována elektroforézou agarózového gelu. Pro real-time PCR celková RNA byla zpětně přepsána do cDNA pomocí Super-Script first-strand synthesis system (TransGen Biotech) podle pokynů výrobce., Na cDNA byla použita jako templát provést real-time PCR s genově specifickými primery (Další soubor 1: Tabulka S1) a SYBR Green Mix (TaKaRa) ve CFX96 TouchTM Real-Time PCR detection system (Bio-Rad). Actin gen byl použit jako vnitřní normalizace ve vzorcích. Změna ohybu v genové expresi byla vypočtena pomocí hodnot ΔΔCt.

extrakce proteinů a analýzy SDS-PAGE

rozpustné proteinové frakce listů, MCP a GCP byly připraveny podle Li a Assmanna . Všechny následující kroky byly provedeny při 4 °C., Protoplasty a listy prášku smíchané s 40 µl ledově studeného pufru v mikrovláknových zkumavkách. V pufru 50 mM Tris–HCl, pH 7,5, 1 mM MgCl2, 2 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA), 0,25 mM ethyleneglycoltetraacetic kyseliny (EGTA), 250 mM sacharóza, 2 mM dithiothreitolu (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) a 10 µg ml−1 každý z inhibitorů proteázy leupeptin, pepstatin a aprotinin. Homogenát byl udržován na ledu po dobu 20 minut a poté centrifugován na 10 000×g po dobu 15 minut a supernatant byl použit pro 10% SDS-PAGE. Koncentrace bílkovin byly měřeny značkovými soupravami.