植物成長

トマトCM（Castlemart、野生型）の種子を発芽させ、水耕栽培または基質培養において18℃の光の27時間および6時間の暗闇の18℃の下で成長チャンバーで成長させた。 Gcpの調製のために、健全な真の葉が膨張した植物を収穫した(追加ファイル1:Fig. S1および図。 1)., 真の葉の表皮断片を、方法Lまたは方法Sについて記載されているように収集した。

方法L（a–c）および方法S（d–l）における酵素消化の異なる段階で細胞を保護する。 Gcp分離のために選択された水耕植物のa–f七つの完全に拡張された葉（追加ファイル1：図。 S1）。 Gcp分離のために選択された基質培養植物のg–i七完全に拡張された葉。, J–l Gcp分離のために選択された水耕植物（d-fと比較して若い植物）の四つの完全に拡張された葉。 a、d、h、k酵素溶液中で1.5、0.5、2および0.5時間消化した後のGCsの状態1。 b、eは、酵素溶液中での2および1時間の消化後のGCsの状態2である。 c、f、i、l酵素溶液中で3.5、2.5、4.5および1.5時間消化した後のGCsの状態2。 スケールバーは20μmを示す

Gcpの調製：方法L

完全に拡張された真の葉（重量を量った-10g）を水耕トマト植物から収穫した。, 次いで、葉を1分間（20秒の三パルス）ブレンダー（18,000rpm/分）で冷蒸留水250mlでブレンドした。 ブレンドされた葉の混合物を74μmのナイロンメッシュに注ぎ、壊れた葉肉細胞を除去し、ブレンドによって生成された泡のほとんどが大部分が消え、表 次いで、表皮組織を50mlの酵素溶液1を含むフラスコに移し、暗闇の中で振盪水浴中で1.5時間27℃でインキュベートし、振盪速度を100rpmに設定した。, 1.5hのインキュベーションの後、表皮断片を58μmナイロンメッシュ上に収集し、塩基性培地2で穏やかにすすぎ、フラスコ内の50mlの酵素溶液2に移 次いで、断片を含むこの溶液を振盪水浴中で25℃でインキュベートし、gcpの大部分が放出されるまで（典型的には約3.5時間後）、表皮剥離からのGcpの放出を改善するために、フラスコを消化の終わりに数秒間手で穏やかに旋回させた。, さらに、酵素溶液中の皮を、Gcpを放出するために切断された5-mlチップを備えたピペッターに数回穏やかに通過させた。 酵素分解効果を顕微鏡下で評価した。 第二の酵素消化混mixtureを37μmのナイロンメッシュを通して濾過した。 メッシュ上の表皮組織を塩基性培地2ですすぎ、さらにGcpを放出した。 次いで、プロトプラストを含む酵素溶液を15μmのナイロンメッシュを通して濾過し、放出されたGcpを（50mlの遠心チューブ中で）6分間遠心分離によって300×, Gcpを混合細胞および他の破片のペレットから自由なGcpを維持するために、基本培地2で三回洗浄した。 上清を除去した後、容積5mlのプロトプラストを得、これを次の精製または他の実験のために暗闇の中で4℃で保存した。

Gcpの調製：メソッドS

このプロトコルは、酵素溶液の組成を含む1つの変更を伴う”メソッドL”に由来しました。 酵素溶液1は、1.0%(w/v)セルロース”Onozuka”RS、0.01%(w/v)ペクトリアーゼY-23、0.1%(w/v)PVP-40、0.25%(w/v)ウシ血清アルブミンおよび0からなる。,5mM L-アスコルビン酸,塩基性培地に溶解1. 方法Sの改善は、方法Lと比較して2時間必要な時間を短縮した最初の酵素消化はわずか0.5時間を必要とするのに対し、第二の酵素消化は2.5時間および1.5時間を必要とする（若い植物ではFig. 1).

Gcpの精製

gcpから血管組織および汚染物質の断片を除去するために、gcpの純度を有意に改善する追加の精製工程を実施した。, Ｇｃｐｓの精製プロトコルは以前の方法に従っており，ここで説明したトマトに適応した修正を行った。 塩基性溶液2をGcp懸濁液に加え、最終体積8mlを得た。 六ミリリットルのHistopaque（No.1077、Sigma-Aldrich）を慎重に遠心分離管の底にピペットした。 次いで、Ｇｃｐをヒストパクティの上に慎重に層状化した。 チューブを20分間遠心分離し、150×gで遠心分離した後、Gcpをパスツールピペットで二つの溶液の界面から収集し、新しい試験管に移した。, Gcpを塩基性溶液2で希釈し、次いでチューブを6分間遠心分離し、300×gで上清を除去し、単離したGcpを1mlの塩基性溶液2に再懸濁し、その後の試験

プロトプラスト生存率の評価

Gcpの生存率は、フルオレセインジアセテート（FDA）を用いた蛍光測定によって評価した。 色素加水分解は、インキュベーション混合物とGcpを5分間混合した後に観察された。 FDAの動作濃度は、アセトンに溶解した0.01％（w/v）であった。, プロトプラスト調製物を見て、FITCフィルターの組み合わせを使用して青い励起とツァイスアクシオオブザーバー D1蛍光顕微鏡を用いて撮像した。

MCPsの調製

Solanum lycopersicumを単離する方法は、Romanoらによって記載された方法から改変されている。 . 十分に拡大された葉は0.5cm2部分に切られる。 次いで、葉片を30mlの酵素溶液：5mM Mes、0.65M D-マンニトール、1mM CaCl2、0.5%(w:v)マセロザイムR-10(ヤクルト、日本)、1%(w:v)セルラーゼR-10(ヤクルト、日本)、0.25%(w:v)BSA、および0.1%(w:v)PVP-40、pH5.5(KOH)に移す。, 消化は25℃で2時間、水浴中でゆっくりと振とう（分あたり40回の遠足）で行われる。 酵素溶液は穏やかな旋回運動の後に緑色に変わり、プロトプラストの放出を示す。 消化時間は、使用される実験目標および材料に依存する。 葉の部分からすべてのプロトプラストを放出する必要はありません。 解決は37µmのナイロン網を通して50ml遠心分離機の管にろ過する。 保持された葉片を20mlのインキュベーション培地（0.65M D-マンニトール、1mM CaCl2）ですすぎ、濾液も採取する。, 放出されたMcpを5分間遠心分離によって100×gで回収した。0.65M D-マンニトール含有1mM CaCl2でペレットを三回洗浄した。 単離されたＭｃｐを使用するまで暗所で氷上に保存した。

半定量的逆転写PCR解析

全RNAを、Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit(Applied Biosystems,Cat no.12204-01,USA)を用いて、製造業者のプロトコルに従ってGcpおよび葉肉細胞プロトプラスト(Mcp)から抽出した。, 製造業者の指示に従って、Ｓｕｐｅｒ-Ｓｃｒｉｐｔ ｆｉｒｓｔ-ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて全ＲＮＡをｃｄｎａに逆転写した。 プロトプラスト純度を評価するために，ガード細胞または葉肉細胞に特異的に発現した二つの遺伝子を用いて半定量ＲＴ-ＰＣＲを行った。 アクチン遺伝子（フォワードプライマー、5′-CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′;リバースプライマー、5′-TCACCAGAGTCCAACACAA TAC-3’）をRT-PCR実験のための対照として使用した。, The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）分析

qRT-PCRは、優先的にガード細胞で発現またはABA応答のレギュレータとして描かれ、ガード細胞におけるMeJAに応答して転写産物レベルの誘導または抑制を示した四つの遺伝子を用いて行われた。 Gcp懸濁液を室温で1.5mlマイクロフュージュチューブ中で10分間培養し、次いで50μm±MeJA（最終濃度）で5、10、15、20分間処理した。 インキュベーションの後、ガード細胞を同時に収集し、凍結し、さらなる分析まで−80℃で保存した。, プロトプラスティングは、ストレス関連遺伝子の発現を誘導することを考慮すると、二つの異なる転写阻害剤、アクチノマイシンD（33mg/L）とコルディセピン（100mg/L）は、ブレンドの最初のステップを含む、単離のすべての手順で使用された。 転写阻害剤の有無にかかわらず初期創傷応答遺伝子発現のｑｒｔ-ＰＣＲ解析を行った。製造業者のプロトコルに従って、Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit(Applied Biosystems,Cat no.12204-01,USA)を用いて、Gcpから全RNAを単離した。, ゲノムＤＮＡを除去するために、全てのＲＮＡ試料をＲｎａｓｅフリーｄｎａｓｅで消化した。 それぞれのRNAサンプルの品質および濃度をNamedrop2000分光光度計（Thermo Scientific）を用いて決定した。 ＲＮＡの完全性もアガロースゲル電気泳動によりチェックした。 リアルタイムＰＣＲのために、全ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、Ｓｕｐｅｒ-Ｓｃｒｉｐｔ ｆｉｒｓｔ-ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてｃｄｎａに逆転写した。, CDNAを鋳型として用いて、CFX96TouchTMリアルタイムPCR検出システム（Bio-Rad）において、遺伝子特aプライマー（追加ファイル1：表S1）およびSYBR Green Mix（TaKaRa）を用いたリアルタイムPCRを行った。 試料中の内部正規化としてアクチン遺伝子を用いた。 遺伝子発現の折り畳み変化をΔδｃｔ値を用いて計算した。

タンパク質抽出およびSDS-PAGE分析

葉、McpおよびGcpの可溶性タンパク質画分をLiおよびAssmannに従って調製した。 その後のすべての工程を4℃で行った。, Microfugeの管の氷冷たい緩衝の40µlと混合されるProtoplastsおよび葉の粉。 バッファーは、50mMトリスHCl、pH7.5、1mM MgCl2、2mMエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、0.25mMエチレングリコルテトラ酢酸（EGTA）、250mMスクロース、2mMジチオトレイトール（DTT）、1mMフェニルメチルスルホニルフッ化物（PMSF）と10μg ml–1それぞれのプロテアーゼ阻害剤ロイペプチン、ペプスタチンおよびアプロチニンであった。 ホモジネートを氷上に20分間保持し、次いで10,000×gで15分間遠心分離し、上清を10％SDS-PAGEに使用した。 タンパク質濃度は、Ｂｒａｎｄｆｏｒｄ Ｋｉｔｓによって測定した。