næste generations sekventering

introduktion

sekventeringen af det humane genom blev afsluttet i 2003 efter 13 års internationalt samarbejde og investering på USD 3 milliarder. Det menneskelige genomprojekt brugte Sanger-sekventering (omend stærkt optimeret), den vigtigste metode til DNA-sekventering siden opfindelsen i 1970 ‘ erne.

i dag vokser efterspørgslen efter sekventering eksponentielt, hvor store mængder genomisk DNA skal analyseres hurtigt, billigt og præcist., Takket være nye sekventeringsteknologier, der kollektivt er kendt som næste generations sekventering, er det nu muligt at sekvensere et helt humant genom i løbet af få timer.

Sanger-sekventering og Næste-generations sekventering

princippet bag Next Generation Sequencing (NGS) svarer til, at Sanger-sekventering, som bygger på kapillær-elektroforese. Den genomiske streng er fragmenteret, og baserne i hvert fragment identificeres ved udsendte signaler, når fragmenterne ligeres mod en skabelonstreng.,Sanger-metoden krævede separate trin til sekventering ,adskillelse (ved elektroforese) og detektion, hvilket gjorde det vanskeligt at automatisere Prøveforberedelsen, og den var begrænset i gennemstrømning, skalerbarhed og opløsning. NGS-metoden bruger array-baseret sekventering, som kombinerer de teknikker, der er udviklet i Sanger sekventering til at behandle millioner af reaktioner parallelt, hvilket resulterer i meget høj hastighed og gennemstrømning til en reduceret pris., Genomsekvenseringsprojekterne, der tog mange år med Sanger-metoder, kan nu afsluttes i timer med NGS, skønt med kortere læselængder (antallet af baser, der er sekventeret ad gangen) og mindre nøjagtighed.,

Næste generation af metoder til DNA-sekventering har tre overordnede trin:

• Bibliotek forberedelse: biblioteker er skabt ved hjælp af tilfældige fragmentering af DNA, efterfulgt af ligation med brugerdefinerede linkers
• Forstærkning: biblioteket er forstærket ved hjælp af en forstærkning metoder og PCR
• Rækkefølge: DNA er opdelt ved hjælp af en af flere forskellige metoder

Bibliotek forberedelse

for det Første, at DNA er fragmenteret enten enzymatisk eller ved sonication (excitation ved hjælp af ultralyd) til at skabe mindre dele., Adaptere (korte, dobbeltstrengede stykker syntetisk DNA) ligeres derefter til disse fragmenter ved hjælp af DNA-ligase, et en .ym, der forbinder DNA-strenge. Adapterne gør det muligt for sekvensen at blive bundet til et komplementært modstykke.

adaptere syntetiseres således, at den ene ende er ‘klæbrig’, mens den anden er ‘stump’ (ikke-sammenhængende) med henblik på at forbinde den stumpe ende til det stumpe endede DNA. Dette kan føre til det potentielle problem med baseparring mellem molekyler og derfor dimerdannelse., For at forhindre dette udnyttes den kemiske struktur af DNA, da ligering finder sted mellem 3′-OH og 5 ‘ – P enderne. Ved at fjerne fosfat fra den klæbrige ende af adapteren, og derfor skabe en 5’-OH ende i stedet, DNA-ligase er i stand til at danne en bro mellem de to termini (Figur 1).,

for sekventering til at blive en succes, biblioteket fragmenter nødt til at være rumligt grupperet i PCR-kolonier eller ‘polonies”, som de er traditionelt kendt, som består af mange kopier af et bestemt bibliotek fragment. Da disse polonier er fastgjort på en plan måde, kan funktionerne i arrayet manipuleres en .ymatisk parallelt. Denne metode til bibliotekskonstruktion er meget hurtigere end den tidligere arbejdskraftintensive procedure for koloniplukning og E., coli kloning bruges til at isolere og amplificere DNA til Sanger sekventering, men dette er på bekostning af læselængde af fragmenterne.

amplifikation

Bibliotekforstærkning er påkrævet, så det modtagne signal fra Se .uenceren er stærkt nok til at blive detekteret nøjagtigt. Ved en .ymatisk forstærkning kan fænomener som ‘forspænding’ og ‘duplikering’ forekomme, hvilket fører til præferenceforstærkning af visse biblioteksfragmenter. I stedet er der flere typer amplifikationsproces, der bruger PCR til at skabe et stort antal DNA-klynger.,

Emulsion PCR

Emulsionsolie, perler, PCR-blanding og bibliotekets DNA blandes til dannelse af en emulsion, der fører til dannelse af mikrobrønde (figur 2).

for sekventering proces til at blive en succes, hver micro bør indeholde en perle med en streng af DNA (ca 15% af mikro-brønde er af denne sammensætning). PCR denaturerer derefter biblioteksfragmentet, der fører to separate tråde, hvoraf den ene (den omvendte streng) annealer til perlen., Det udglødte DNA forstærkes ved polymerase, der starter fra perlen mod primerstedet. Den oprindelige omvendte streng denaturerer derefter og frigøres kun fra perlen for at annealere til perlen for at give to separate tråde. Disse forstærkes begge for at give to DNA-strenge fastgjort til perlen. Processen gentages derefter over 30-60 cyklusser, der fører til klynger af DNA. Denne teknik er blevet kritiseret for sin tidskrævende natur, da den kræver mange trin (dannelse og brud på emulsionen, PCR-amplifikation, berigelse osv.), Det er også relativt ineffektivt, da kun omkring to tredjedele af emulsionsmikroreaktorerne faktisk vil indeholde en perle. Derfor kræves et ekstra skridt for at adskille tomme systemer, der fører til flere potentielle unøjagtigheder.

Bridge PCR

overfladen af Flo .cellen er tæt belagt med primere, der er komplementære til primerne fastgjort til DNA-biblioteksfragmenterne (figur 3). DNA ‘ et fastgøres derefter tilfældigt til overfladen af cellen, hvor det udsættes for reagenser til polymerasebaseret forlængelse., Ved tilsætning af nukleotider og en .ymer binder de frie ender af de enkelte DNA-strenge sig til overfladen af cellen via komplementære primere, hvilket skaber broede strukturer. En .ymer interagerer derefter med broerne for at gøre dem dobbeltstrengede, så når denatureringen finder sted, er to enkeltstrengede DNA-fragmenter fastgjort til overfladen i umiddelbar nærhed. Gentagelse af denne proces fører til klonale klynger af lokaliserede identiske tråde. For at optimere klyngedensiteten skal koncentrationerne af reagenser overvåges meget nøje for at undgå overfyldning.,

Sekventering

Flere konkurrerende metoder til Next Generation Sequencing er blevet udviklet af forskellige virksomheder.

454 Pyrosekventering

Pyrosekventering er baseret på “sekventering af syntese” – princippet, hvor en supplerende strand er syntetiseret i tilstedeværelsen af enzymet polymerase (Figur 4). I modsætning til at bruge dideo .ynukleotider til at afslutte kædeforstærkning (som ved Sanger-sekventering), detekterer pyrosekventering i stedet frigivelsen af pyrophosphat, når nukleotider tilsættes til DNA-kæden., Den bruger oprindeligt emulsions-PCR-teknikken til at konstruere de polonier, der kræves til sekventering og fjerner den komplementære streng. Dernæst en ssdna sekventering primer hybridiserer til enden af strengen (primer-binding region), derefter de fire forskellige dNTP ‘ er derefter sekventielt lavet til at flyde ind og ud af brøndene over polonies. Når den korrekte dNTP en .ymatisk inkorporeres i strengen, forårsager det frigivelse af pyrophosphat. I nærvær af ATP svovlylase og adenosin omdannes pyrophosphatet til ATP., Dette ATP-molekyle bruges til luciferase-katalyseret omdannelse af luciferin til O .yluciferin, der producerer lys, der kan detekteres med et kamera. Den relative intensitet af lys er proportional med mængden af base tilsat (dvs.en top på to gange intensiteten indikerer to identiske baser er blevet tilføjet i rækkefølge).,

Pyrosekventering, der er udviklet af 454 Life Sciences, var en af de tidlige succeser af Næste-generations sekventering; ja, 454 Life Sciences produceret den første kommercielt tilgængelige Næste-generation-sequencer. Metoden blev imidlertid formørket af andre teknologier, og i 2013 annoncerede nye ejere Roche lukningen af 454 Life Sciences og afbrydelsen af 454 pyrose .uencing-platformen.,

ion torrent halvleder sekventering

Ion torrent sekventering bruger en “sekventering ved syntese” tilgang, hvor en ny DNA-streng, komplementær til målstrengen, syntetiseres en base ad gangen. En halvlederchip registrerer hydrogenionerne produceret under DNA-polymerisering (figur 5).

efter polonidannelse under anvendelse af emulsions-PCR oversvømmes DNA-biblioteksfragmentet sekventielt med hvert nukleosidtrifosfat (dNTP), som ved pyrosekventering. DNTP inkorporeres derefter i den nye streng, hvis den er komplementær til nukleotidet på målstrengen., Hver gang et nukleotid med succes tilsættes, frigives en hydrogenion, og den detekteres af se .uencerens pH-sensor. Som i pyrosekventeringsmetoden, hvis mere end et af det samme nukleotid tilsættes, er ændringen i pH/signalintensitet tilsvarende større.

Ion torrent-sekventering er den første kommercielle teknik ikke at bruge fluorescens og kamera scanning, og det er derfor hurtigere og billigere end mange af de andre metoder., Desværre kan det være svært at opregne antallet af identiske baser tilføjet fortløbende. For eksempel kan det være vanskeligt at differentiere ph-ændringen for en homorepeat af Længde 9 til en af Længde 10, hvilket gør det vanskeligt at afkode gentagne sekvenser.

Sekventering ved ligering (SOLiD)

Fast er en enzymatisk metode til sekvensering, der bruger DNA-ligase, et enzym, der bruges bredt i bioteknologi for sin evne til at ligate dobbelt-strenget DNA-strenge (Figur 6)., Emulsion PCR bruges til at immobilisere / amplificere en ssdna primer-bindende region (kendt som en adapter), som er blevet konjugeret til målsekvensen (dvs.den sekvens, der skal sekventeres) på en perle. Disse perler deponeres derefter på en glasoverflade-der kan opnås en høj densitet af perler, som igen øger teknikkens gennemstrømning.

Når perleaflejring har fundet sted, hybridiseres en primer med længde N til adapteren, derefter udsættes perlerne for et bibliotek med 8-mer-sonder, der har forskellige fluorescerende farvestof i 5′ – enden og en hydro .ylgruppe i 3′ – enden., Baser 1 og 2 er komplementære til de nukleotider, der skal sekventeres, mens baser 3-5 er degenererede og baser 6-8 er inosinbaser. Kun en komplementær sonde hybridiserer til målsekvensen ved siden af primeren. DNA-ligase bruges derefter til at slutte sig til 8-mer-sonden til primeren. En phosphorothioatbinding mellem baser 5 og 6 tillader, at det fluorescerende farvestof spaltes fra fragmentet ved anvendelse af sølvioner., Denne spaltning gør det muligt at måle fluorescens (fire forskellige fluorescerende farvestoffer anvendes, som alle har forskellige emissionsspektre) og genererer også en 5′-phosphatgruppe, som kan gennemgå yderligere ligering. Når den første runde af sekventering er afsluttet, udvidelse produkt er smeltet væk, og derefter en anden runde af sekventering er opført med en primer, af længde N−1. Mange runder af sekventering ved hjælp af kortere primere hver gang (dvs.N−2, N−3 osv.) og måling af fluorescensen sikrer, at målet er sekventeret.,

på Grund af den to-base-sekventering metode (da hver base er effektivt sekventeret to gange), SOLiD teknik er meget præcise (på 99.999% med en sjette primer, det er den mest nøjagtige af anden generation af platforme), og også billigt. Det kan gennemføre et enkelt løb på 7 dage og kan i den tid producere 30 Gb data. Desværre er dens største ulempe, at læselængder er korte, hvilket gør det uegnet til mange applikationer.,

Reversible terminator-sekventering (Illumina)

Reversible terminator-sekventering adskiller sig fra den traditionelle Sanger metode i, at i stedet for at afslutte primer extension uigenkaldeligt hjælp dideoxynucleotide, modificerede nukleotider bruges i reversibel opsigelse. Mens mange andre teknikker bruger emulsions-PCR til at forstærke DNA-bibliotekets fragmenter, reversibel terminering bruger bro-PCR, hvilket forbedrer effektiviteten af dette trin i processen.,Reversible terminatorer kan inddeles i to kategorier: 3′-o-blokerede reversible terminatorer og 3′-blokerede reversible terminatorer.

3′-o-blokerede reversible terminatorer

mekanismen anvender en sekventering ved syntesemetode, der forlænger primeren trinvist. For det første er sekventering primere og skabeloner fastgjort til en solid støtte. Understøttelsen udsættes for hver af de fire DNA-baser, som har en anden fluorofor bundet (til den nitrogenholdige base) ud over en 3′-o-a .idomethylgruppe (Figur 7).,

kun den korrekte base annealer til målet og ligeres derefter til primeren. Den faste understøtning afbildes derefter, og nukleotider, der ikke er inkorporeret, vaskes væk, og den fluorescerende gren spaltes ved hjælp af TCEP (tris(2-Carbo .yethyl)phosphin). TCEP fjerner også 3 ‘- o-a .idomethylgruppen, der regenererer 3’-OH, og cyklussen kan gentages (figur 8) .,

3′-ublokeret reversible terminators

Den reversible opsigelse gruppe af 3′-ublokeret reversible terminators er knyttet til både base og fluorescens-gruppe, som nu fungerer som en del af opsigelsen gruppe, samt en journalist. Denne metode adskiller sig fra 3 ‘-O-blokerede reversible terminatorer på tre måder: for det første blokeres 3 ‘ – positionen ikke (dvs., basen har fri 3 ‘ – OH); fluoroforen er den samme for alle fire baser; og hver modificeret base flyder i rækkefølge snarere end på samme tid.

den største ulempe ved disse teknikker ligger i deres dårlige læselængde, som kan skyldes et af to fænomener. For at forhindre inkorporering af to nukleotider i et enkelt trin indføres en blok, men i tilfælde af ingen bloktilsætning på grund af en dårlig syntese kan tråde blive ude af fase og skabe støj, der begrænser læselængden. Støj kan også skabes, hvis fluoroforen ikke er fastgjort eller fjernet., Disse problemer er fremherskende i andre sekventeringsmetoder og er de vigtigste begrænsende faktorer for at læse længde.

denne teknik blev banebrydende af Illumina, med deres Hise.og mise. platforme. Hise.er den billigste af anden generation se .uencere med en pris på $0.02 per million baser. Det har også en høj dataudgang på 600 Gb pr.

tredje generations sekventering

en ny kohorte af teknikker er siden blevet udviklet ved hjælp af enkeltmolekylsekventering og enkelt realtidsekventering, hvilket fjerner behovet for klonal amplifikation., Dette reducerer fejl forårsaget af PCR, forenkler bibliotekets forberedelse og, vigtigst af alt, giver en meget højere læselængde ved hjælp af højere gennemløbsplatforme. Eksempler omfatter Pacific Biosciences’ platform, som bruger SMQYART (enkelt molekyle real-time) – sekventering til at give læse-længder på omkring tusind baser og Helicos Biosciences, der udnytter enkelt molekyle, sekventering og derfor ikke kræver forstærkning forud for sekventering. O .ford Nanopore-teknologier udvikler i øjeblikket siliciumbaserede nanoporer, der udsættes for en strøm, der ændrer sig, når DNA passerer gennem porerne., Dette forventes at være en hurtig gennemløbsmetode til DNA-sekventering, selvom problemer som at bremse transport gennem porerne først skal løses.

sekventering epigenetiske modifikationer

ligesom næste generations sekventering aktiveret genomisk sekventering i massiv skala, er det blevet klart for nylig, at den genetiske kode ikke indeholder alle de oplysninger, der kræves af organismer. Epigenetiske modifikationer af DNA-Baser, især 5-methylcytosin, formidler også vigtig information.,

Alle anden generations sekventeringsplatforme afhænger, som Sanger-sekventering, af PCR og kan derfor ikke sekvens modificerede DNA-Baser. Faktisk behandles både 5-methylcytosin og 5-hydro .ymethylcytosin som cytosin af de en .ymer, der er involveret i PCR; derfor går epigenetisk information tabt under sekventering.,

Natriumbisulfit sekventering

Natriumbisulfit sekventering udnytter forskellen i reaktiviteten af cytosin og 5-methylcytosine med hensyn til natriumbisulfit: cytosin er deamineret af natriumbisulfit for at danne uracil (der lyder som T, når sekventeret), der henviser til, at 5-methylcytosine er ureaktivt (dvs lyder som C). Hvis to sekventeringskørsler udføres parallelt, en med bisulfit-behandling og en uden, indikerer forskellene mellem udgangene fra de to kørsler methylerede cytosiner i den oprindelige sekvens., Denne teknik kan også bruges til dsDNA, da strengene efter behandling med bisulfit ikke længere er komplementære og kan behandles som ssdna.

5-Hydroxymethylcytosine, en anden vigtig epigenetisk modifikation, reagerer med natriumbisulfit for at danne cytosin-5-methylsulfonate (der lyder som C, når sekventeret). Dette komplicerer sager noget, og betyder, at bisulfit sekventering ikke kan bruges som en sand indikator for methylering i sig selv.,

Oxidative natriumbisulfit sekventering

Oxidative natriumbisulfit sekventering tilføjer en kemisk oxidation trin, som konverterer 5-hydroxymethylcytosine til 5-formylcytosine ved hjælp af kalium perruthenate, KRuO4, før natriumbisulfit behandling. 5-Formylcytosin deformyleres og deamineres til dannelse af uracil ved bisulfit-behandling. Nu er tre separate sekventeringskørsler nødvendige for at skelne cytosin, 5-methylcytosin og 5-hydro .ymethylcytosin (se figur 9).,

Programmer af Næste-generations sekventering

Next generation sequencing har gjort det muligt for forskere at indsamle enorme mængder af genomiske sekventering data., Denne teknologi har et væld af applikationer, såsom: at diagnosticere og forstå komplekse sygdomme; hel-genom-sekventering; analyse af epigenetiske modifikationer; mitokondrie-sekventering; transkriptom-sekventering − forståelse af, hvordan ændret udtryk af genetiske varianter, der påvirker en organisme; og exome sekventering − mutationer i exome er tænkt til at rumme op til 90% af mutationer i den menneskelige arvemasse, der fører til sygdom., DNA-teknikker er blevet brugt til at identificere og isolere gener, der er ansvarlige for visse sygdomme, og tilvejebringe den korrekte kopi af det defekte gen kendt som ‘genterapi’.

et stort fokusområde i genterapi er kræftbehandling – en potentiel metode ville være at introducere et antisense RNA (som specifikt forhindrer syntesen af et målrettet protein) til onkogen, der udløses til dannelse af tumorceller. En anden metode hedder ‘selvmord genterapi’, som introducerer gener til at dræbe kræftceller selektivt., Mange genetiske koder for giftige proteiner og en .ymer er kendt, og introduktion af disse gener i tumorceller ville resultere i celledød. Vanskeligheden ved denne metode er at sikre et meget præcist leveringssystem for at forhindre at dræbe sunde celler.
Disse metoder er gjort muligt ved sekventering til at analysere tumor genomer, hvilket giver medicinske eksperter i at skræddersy kemoterapi og andre kræftbehandlinger mere effektivt til deres patienters unikke genetiske sammensætning, revolutionerer den diagnostiske faser af personlig medicin.,

da omkostningerne ved DNA-sekventering går ned, bliver det mere udbredt, hvilket bringer en række problemer. Sekventering producerer enorme mængder data, og der er mange beregningsmæssige udfordringer forbundet med behandling og lagring af data. Der er også etiske spørgsmål, såsom ejerskabet af en persons DNA, når DNA ‘ et sekventeres. DNA-sekventeringsdata skal opbevares sikkert, da der er bekymring for, at forsikringsgrupper, realkreditmæglere og arbejdsgivere kan bruge disse data til at ændre forsikringskurser eller skelne mellem kandidater., Sekventering kan også hjælpe med at finde ud af, om en person har en øget risiko for en bestemt sygdom, men om patienten informeres, eller om der er en kur mod sygdommen, er et andet spørgsmål helt.

Ahmadian, A.; Svahn, H.; massivt parallelt. Sekventering platforme ved hjælp Lab på en Chip-teknologier. Lab Chip, 11, 2653 − 2655 (2011).

Balasubramanian, S.; sekventering af nukleinsyrer: fra kemi til medicin. Chem. Commun. 47, 7281 − 7286 (2011).

Mardis, E.; næste generations DNA-sekventeringsmetoder. Annu. Pastor Genomics Brummer. Genet. 9, 387 − 402 (2008).

Mardis, E.,; Næste generations DNA-Sekventeringsplatforme. Annu. Pastor Anal. Chem. 6, 287-303 (2013).shendure, J.; Ji, H.; næste generations DNA-sekventering. Nat. Bioteknologi. 26, 10 1135-1144 (2008).

Se også

Vores gratis online nukleinsyrer Bog indeholder oplysninger om alle aspekter af nukleinsyrer, kemi og biologi.