Pflanzenwachstum

Samen von Tomatenpflanzen (Castlemart, Wildtyp) wurden gekeimt und in einer Wachstumskammer unter 18 h Licht bei 27 °C und 6 h Dunkelheit bei 18 °C in Hydrokultur oder Substratkultur gezüchtet. Pflanzen mit gesunden expandierten echten Blättern wurden zur Herstellung von GCPs geerntet (Zusätzliche Datei 1: Abb. S1 und Abb. 1)., Die epidermalen Fragmente echter Blätter wurden gesammelt, wie für Methode L oder Methode S beschrieben.

Schutzzellen in verschiedenen Stadien der enzymatischen Verdauung in Methode L (a–c) und Methode S (d–l). a-f Sieben vollständig expandierte Blätter der für die GCPs-Isolierung ausgewählten hydroponischen Pflanzen (Zusätzliche Datei 1: Abb. S1). g-i Sieben vollständig expandierte Blätter der Substratkulturpflanzen, die für die GCPs-Isolierung ausgewählt wurden., j-l Vier vollständig expandierte Blätter der hydroponischen Pflanzen (jüngere Pflanzen im Vergleich zu d–f), die für die GCPs-Isolierung ausgewählt wurden. a, d, h, k Der Status von GCs nach 1,5, 0,5, 2 und 0,5 h der Verdauung in Enzymlösung 1. b, e Der Status von GCs nach 2 und 1 h der Verdauung in Enzymlösung 2. c, f, i, l Der Status von GCs nach 3,5, 2,5, 4,5 und 1,5 h Verdauung in Enzymlösung 2. Skalenbalken zeigen 20 µm

Vorbereitung von GCPs: Methode L

Die vollständig expandierten echten Blätter (gewogen ~ 10 g) wurden aus hydroponischen Tomatenpflanzen geerntet., Dann wurden die Blätter für 1 min (drei Impulse von 20 s) in einem Mixer (18.000 U/min) in 250 ml kalt destilliertem Wasser gemischt. Die gemischte Blattmischung wurde durch ein 74-µm-Nylongewebe gegossen, um gebrochene Mesophyllzellen zu entfernen, und mehrmals mit kaltem destilliertem Wasser gespült, bis der größte Teil des durch Mischen erzeugten Schaums weitgehend verschwunden war und die epidermalen Fragmente blassgrün waren. Anschließend wurden die Epidermisgewebe in einen Kolben mit 50 ml Enzymlösung 1 überführt, der 1,5 h bei 27 °C in einem Schüttelwasserbad in Dunkelheit inkubiert wurde, wobei die Schüttelgeschwindigkeit auf 100 U / min eingestellt war., Nach 1,5 h Inkubation wurden epidermale Fragmente auf einem 58-µm-Nylongewebe gesammelt, vorsichtig mit basischem Medium 2 gespült und in 50 ml Enzymlösung 2 in einem Kolben überführt. Diese Lösung, die die Fragmente enthielt, wurde dann bei 25 °C in einem Schüttelwasserbad (70 U / min) inkubiert, bis die meisten GCPs freigesetzt wurden, typischerweise nach ungefähr 3,5 h. Um die Freisetzung von GCPs aus den epidermalen Peelings zu verbessern, wurde der Kolben am Ende der Verdauung einige Sekunden lang sanft von Hand gewirbelt. , Zusätzlich wurden die Peelings in der Enzymlösung mehrmals sanft durch einen Pipettor geführt, der mit einer 5-ml-Spitze ausgestattet war, die geschnitten wurde, um die GCPs freizusetzen. Die enzymolysis Wirkung beurteilt wurde unter einem Mikroskop. Die zweite Enzymverdauungsmischung wurde durch 37 µm Nylongewebe filtriert. Die epidermalen Gewebe auf dem Netz wurden mit basischem Medium 2 gespült, um GCPs weiter freizusetzen. Die Enzymlösung, die die Protoplasten enthielt, wurde dann durch ein 15-µm-Nylongewebe filtriert, und die freigesetzten GCPs wurden (in 50-ml-Zentrifugenröhrchen) durch Zentrifugation für 6 min bei 300×g gesammelt., Die GCPs wurden dreimal mit basischem Medium 2 gewaschen, um GCPs frei von gemischten Zellen und anderen Ablagerungen zu halten. Nach dem Entfernen des Überstands wurde ein Volumen von 5 ml Protoplasten ergeben, das bei 4 °C im Dunkeln für die nächste Reinigung oder für andere Experimente gelagert wurde.

Herstellung von GCPs: Methode S

Dieses Protokoll wurde von „Methode L“ abgeleitet, wobei eine Modifikation die Zusammensetzung der Enzymlösung 1 betraf. Enzym-Lösung 1 besteht 1,0% (w/v) cellulose „Onozuka“ RS, 0,01% (w/v) Pectolyase Y-23, 0,1% (w/v) PVP-40, 0.25% (w/v) rinderserumalbumin und 0.,5 mM L-Ascorbinsäure, gelöst in basischem Medium 1. Die Verbesserung der Methode S reduzierte den Zeitbedarf um 2 h gegenüber Methode L. Die erste Enzymverdauung benötigt nur 0,5 h, während die zweite Enzymverdauung 2,5 h und 1,5 h benötigt (bei Jungpflanzen Abb. 1).

Reinigung von GCPs

Um Fragmente von Gefäßgewebe und Verunreinigungen aus GCPs zu entfernen, wurde ein zusätzlicher Reinigungsschritt durchgeführt, der die Reinheit der GCPs signifikant verbessert., Das Reinigungsprotokoll der GCPs wurde nach dem der bisherigen Verfahren, mit Modifikationen angepasst für Tomaten hier beschrieben. Der GCPs-Suspension wurde Grundlösung 2 zugesetzt, um ein Endvolumen von 8 ml zu erhalten. Sechs Milliliter Histopaken (Nr. 1077, Sigma-Aldrich) wurden vorsichtig in den Boden eines Zentrifugenröhrchens pipettiert. Die GCPs wurden dann sorgfältig auf den Histopaken geschichtet. Die Röhrchen wurden für 20 min bei 150×g zentrifugiert, wonach die GCPs mit einer Pasteurpipette von der Grenzfläche der beiden Lösungen gesammelt und in ein neues Reagenzglas überführt wurden., Die GCPs wurden mit Grundlösung 2 verdünnt, und dann wurden die Röhrchen für 6 min bei 300×g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und die isolierten GCPs wurden in 1 ml Grundlösung 2 resuspendiert und im Dunkeln bis zu nachfolgenden Tests auf Eis gehalten.

Beurteilung der Lebensfähigkeit von Protoplasten

Die Lebensfähigkeit von GCPs wurde durch Fluoreszenzmessungen mit Fluoresceindiacetat (FDA) bewertet. Die Farbstoffhydrolyse wurde nach dem Mischen von GCPs mit der Inkubationsmischung für 5 min beobachtet. Die Betriebskonzentration von FDA betrug 0,01% (w/v) gelöst in Aceton., Protoplastenpräparate wurden unter Verwendung eines Zeiss Axio Observer D1 Fluoreszenzmikroskops mit blauer Anregung unter Verwendung der FITC-Filterkombination betrachtet und abgebildet.

Herstellung von MCPs

Das Verfahren zur Isolierung von Solanum lycopersicum wird von dem von Romano et al. . Vollständig expandierte Blätter werden in 0,5 cm2 Stücke geschnitten. Die blattstücke sind dann übertragen, um 30 ml Enzym-Lösung: 5 mM Mes, 0,65 M D-mannitol, 1 mM CaCl2, 0.5% (w: v) Macerozyme R-10 (Yakult, Japan), 1% (w: v) Cellulase R-10 (Yakult, Japan), 0.25% (w: v) BSA und 0,1% (w: v) PVP-40, pH-Wert 5,5 (KOH)., Die Verdauung erfolgt bei 25 °C für 2 h mit langsamem Schütteln (40 G pro Minute) in einem Wasserbad. Die Enzymlösung wird nach einer sanften Wirbelbewegung grün, was auf die Freisetzung von Protoplasten hinweist. Die Verdauungszeit hängt von den verwendeten experimentellen Zielen und Materialien ab. Es ist nicht notwendig, alle Protoplasten aus Blattstücken freizusetzen. Die Lösung wird durch 37 µm Nylongewebe in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen filtriert. Die zurückgehaltenen Blattstücke werden mit 20 ml Inkubationsmedium (0,65 M D-Mannitol, 1 mM CaCl2) gespült und das Filtrat wird ebenfalls gesammelt., Die freigesetzten MCPs wurden durch Zentrifugation für 5 min bei 100×g gesammelt, Das Pellet wurde dreimal mit 0,65 M D-Mannitol, das 1 mM CaCl2 enthielt, gewaschen. Isolierte MCPs wurden bis zur Verwendung im Dunkeln auf Eis gelagert.

Semi-quantitative Reverse-Transcription-PCR-Analysen

Die gesamte RNA wurde aus GCPs und Mesophyllzellprotoplasten (MCPs) unter Verwendung des Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Cat no. 12204-01, USA) gemäß dem Herstellerprotokoll extrahiert., Die gesamte RNA wurde mit dem Super-Script First-Strand Synthesis System (TransGen Biotech) gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA reverse transkribiert. Semi-quantitative RT-PCR wurde mit zwei Genen durchgeführt, die spezifisch in Schutzzellen oder Mesophyllzellen exprimiert wurden, um die Protoplastenreinheit zu beurteilen. Das Aktin-gen (forward-primer, 5′-CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′; reverse primer, 5′-TCACCAGAGTCCAACACAA TAC-3′) wurde als Kontrolle für die RT-PCR-Experimente., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) Analysen

Die qRT-PCR wurde mit vier Genen durchgeführt, die bevorzugt in Schutzzellen exprimiert oder als Regulatoren der ABA-Reaktion dargestellt wurden und eine Induktion oder Repression auf Transkriptebene als Reaktion auf MeJA in Schutzzellen zeigten. GCPs Suspension inkubiert in 1,5 ml Mikrofugenröhrchen bei Raumtemperatur für 10 min, und dann behandelt mit 50 µM ± MeJA (Endkonzentration) für 5, 10, 15, 20 min. Nach der Inkubation wurden die Zellen gleichzeitig gesammelt, eingefroren und bei − 80 °C bis zur weiteren Analyse gelagert., In Anbetracht der Tatsache, dass Protoplasting die Expression von stressassoziierten Genen induziert, wurden zwei verschiedene Transkriptionsinhibitoren, Actinomycin D (33 mg/l) und Cordycepin (100 mg/l), in allen Verfahren der Isolierung verwendet, einschließlich des ersten Mischschritts . Die qRT-PCR-Analysen von der frühen Wunde-response Gene expression mit oder ohne Transkription-Inhibitoren durchgeführt wurden.

Die gesamte RNA wurde aus dem GCPs isoliert, wobei Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Cat no. 12204-01, USA) gemäß dem Herstellerprotokoll verwendet wurde., Alle RNA-Proben wurden mit RNase-freier DNase verdaut, um genomische DNA zu entfernen. Die Qualität und Konzentration der einzelnen RNA-Proben wurde mittels Namedrop 2000 Spektralphotometer (Thermo Scientific) bestimmt. Die Integrität der RNA wurde auch durch Agarosegelelektrophorese überprüft. Für die Echtzeit-PCR wurde die gesamte RNA mithilfe des Super-Script First-Strand Synthesis System (TransGen Biotech) gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA reverse transkribiert., Die cDNA wurde als Vorlage verwendet, um Echtzeit-PCR mit genspezifischen Primern (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S1) und SYBR Green Mix (TaKaRa) in einem CFX96 TouchTM Echtzeit-PCR-Detektionssystem (Bio-Rad) durchzuführen. Actin-Gen wurde als interne Normalisierung in Proben verwendet. Die Veränderung der Genexpression wurde unter Verwendung von ΔΔCt-Werten berechnet.

Proteinextraktion und SDS-PAGE Analysen

Lösliche Proteinfraktionen von Blättern, MCPs und GCPs wurden nach Li und Assmann hergestellt . Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 4 °C durchgeführt., Protoplasten und Blattpulver gemischt mit 40 µl eiskaltem Puffer in Mikrofugenröhrchen. Der Puffer betrug 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM MgCl2, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,25 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EGTA), 250 mM Saccharose, 2 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und jeweils 10 µg ml−1 der Proteaseinhibitoren Leupeptin, Pepstatin und Aprotinin. Das Homogenat wurde 20 min auf Eis gehalten und dann 15 min bei 10.000×g zentrifugiert und der Überstand für 10% SDS-PAGE verwendet. Die Proteinkonzentrationen wurden mit den Brandford Kits gemessen.