muchas aplicaciones biológicas como Microbiología, cultivo celular, análisis de sangre y muchas otras que usan células requieren que determinemos la concentración celular para nuestro experimento.

el conteo de células es bastante sencillo y requiere una cámara de conteo llamada hemocitómetro, un dispositivo inventado por el anatomista francés del siglo XIX Louis-Charles Malassez para realizar recuentos de células sanguíneas. Un hemocitómetro consiste en un portaobjetos de vidrio grueso con una cuadrícula de líneas perpendiculares grabadas en el medio., La cuadrícula tiene dimensiones especificadas para que se conozca el área cubierta por las líneas, lo que permite contar el número de celdas en un volumen específico de solución.

la Figura 1. Un hemocitómetro clásico

El tipo más común de hemocitómetro tiene una forma de» H » grabada en el medio que encierra dos superficies de rejilla pulidas como espejo separadas y proporciona el área de montaje de deslizamiento de la cubierta (Figura 1).,

cargar el hemocitómetro

antes de comenzar, asegúrese de que tanto el hemocitómetro como su cubreobjetos estén limpios eliminando cualquier partícula de polvo con papel de lente. Los cubreobjetos que se utilizan para el montaje en hemocitómetros están especialmente hechos para ser más gruesos que los cubreobjetos de microscopía convencionales porque deben ser capaces de superar la tensión superficial de una gota de líquido.

asegúrese de colocar primero el cubreobjetos sobre la superficie de conteo antes de cargar la suspensión celular., Luego coloque la punta de la pipeta con la muestra en uno de los pocillos en forma de V, como en la Figura 2, y expulse suavemente la muestra. El área debajo del cubreobjetos se llena por acción capilar. Se debe introducir suficiente líquido para que la superficie espejada se cubra, generalmente alrededor de 10 µl, pero no se llene en exceso. Puede cargar dos muestras en un hemocitómetro, una en cada una de las dos rejillas.

la Figura 2., Carga del hemocitómetro

El hemocitómetro cargado se coloca en la etapa del microscopio y la rejilla de conteo se enfoca a baja potencia. Deje que la muestra se asiente durante un par de minutos y evite mover el cubreobjetos, ya que podría introducir burbujas de aire y dificultar el recuento.

Conteo de células en un hemocitómetro

la cuadrícula completa en un hemocitómetro contiene nueve cuadrados, cada uno de los cuales es de 1 mm2 (Figura 3). El área central de conteo del hemocitómetro (figura 3B) contiene 25 cuadrados grandes y cada cuadrado grande tiene 16 cuadrados más pequeños., Al contar, cuente solo las celdas en las líneas de dos lados del cuadrado grande para evitar contar las celdas dos veces (figura 3G). Las suspensiones deben diluirse lo suficiente para que las células u otras partículas no se superpongan entre sí en la rejilla, y deben distribuirse uniformemente.

la Figura 3. Conteo de células en el hemocitómetro.

para distinguir entre células muertas y células viables, la muestra a menudo se diluye con una tinción en particular, como el azul de Tripano., Este método de tinción, también conocido como tinción de exclusión de tinte, utiliza un tinte diazo que penetra selectivamente las membranas celulares de las células muertas, coloreándolas de azul, mientras que no es absorbido por las membranas de las células vivas, excluyendo así a las células vivas de la tinción. Cuando se observa bajo un microscopio, las células muertas aparecería como azul oscuro (Figura 4)

la Figura 4. Azul tripano exclusión de células vivas en el hemocitómetro. (La flecha indica la absorción de tinte a través de la membrana de las células muertas.,)

para realizar el conteo, determine la ampliación necesaria para reconocer el tipo de celda deseado y cuente sistemáticamente las celdas en cuadrados seleccionados para que el conteo total sea de aproximadamente 100 celdas, un número mínimo de celdas necesarias para un conteo estadísticamente significativo.

para celdas grandes, simplemente puede contar las celdas dentro de los cuatro cuadrados de esquina grandes (figura 3C-F) y el del medio (figura 3B). Para una suspensión densa de células pequeñas, es posible que desee contar las células en los cuatro cuadrados externos y medios del cuadrado central (figura 3B) o hacer una suspensión más diluida.,

recuerde si una celda se superpone a una regla, cuéntela como » in «si se superpone a la regla superior o derecha, y» out » si se superpone a la regla inferior o izquierda (figura 3G).

el área del centro (figura 3B) y cada cuadrado de esquina (figura 3C-F) es de 1 mm x 1 mm = 1 mm2: la profundidad de cada cuadrado es de 0,1 mm. el volumen final de cada cuadrado a esa profundidad es de 100nl. ,

una vez que haya obtenido el recuento total de células, la concentración de células se puede calcular a partir de la siguiente fórmula:

así, por ejemplo, si diluye su muestra 1:1 con Trypan blue, y cuenta 325 células en 4 cuadrados de esquina más el cuadrado grande central, el total de células por ml =

Si desea saber cuántas células tiene en su muestra original, simplemente multiplique la concentración de células por el volumen total de la muestra. Por ejemplo, si su volumen de muestra original es de 5 ml, entonces su muestra tiene un total =