Tarkka genomin replikaatio on kriittinen elinkelpoisuuden tahansa organismi. Yleinen käsite kopiointi DNA oli selvää, kun selvittäminen DNA: n double helix rakenne ja tunnistaminen emäsparin täydentävyys (1): yksi osa nucleobases voisi toimia malli synteesi uuden lohkon. Vuosikymmenen kuluessa näistä löydöistä E. coli-bakteerista puhdistettiin aine, joka katalysoi DNA-juosteen monistumista (2). Tätä ainetta kutsuttiin ”polymeraasiksi”. E., coli DNA-polymeraasi I, ensimmäinen DNA-polymeraasi löydetty ei ollut ensisijainen replikatiivinen polymeraasi, vaan yksi mukana lagging strand Okazaki fragment resoluutiota ja DNA korjaus. Tämä enteili tulevaa löytöjä monet DNA-polymeraasi perheet, kukin palvelee tiettyä cellular vaatimukset DNA-replikaation ja korjaus.

DNA-Polymerases toimia perusoikeuksien entsyymejä biotieteiden samasta syystä, että ne ovat kriittinen luonne: ne kopioivat DNA: ta. Polymeraasisovelluksiin kuuluvat DNA-merkinnät, sekvensointi ja vahvistus., Yksi erityinen vahvistus pöytäkirjan polymeraasiketjureaktio (PCR) on laajasti käytetty tekniikka, joka työllistää termofiilinen polymeraasien eksponentiaalisesti vahvistaa erityisiä DNA-segmenttejä (3) ja mahdollistaa erilaisia sovelluksia, ihmisen ja taudinaiheuttajien diagnostiikka molekyyli kloonaus biology labs ympäri maailmaa.

– Polymeraasi Tarkkuus

PCR asettaa samat vaatimukset polymeraasi solu laittaa sen replikointi järjestelmä. Oleellisesti polymeraasin tulee olla luotettava, tarkka ja nopea., – Polymeraasi tarkkuutta tai ”uskollisuus” viittaa taipumus sisällyttää oikea nukleotidin määrittelemä malli strand. Tavalliset PCR-entsyymit ovat, ei yllättävää kyllä, melko tarkkoja. Jopa Thermus aquaticus (Taq) DNA-polymeraasi, pitää low fidelity PCR polymeraasiketjureaktio, vain tekee virheen kerran noin nukleotidin lisäyksiä (12)., – Polymeraasi löytö ja tekniikan ponnisteluja on valmistettu hifi-polymeraaseja, jotka harvoin tehdä pohja korvaaminen virheitä, jotka vaativat DNA-sekvensointi menetelmät lukea miljoonia syntetisoitu emäkset havaita mahdolliset virheet polymerase Kehitysten mittaus-fidelity by yhden molekyylin sekvensointi on tunnistettu Q5® High-Fidelity DNA-Polymeraasi kuin ottaa fidelity 280X suurempi thanTaq DNA-polymeraasi (12).,

Fidelity tarkistuspisteitä: geometrinen valinta aktiivisen ja muualla

DNA-polymerases varmistaa tarkka replikointi käyttää useita molekyyli-tarkistuspisteitä, paikalla nukleotidin liittämistä ja sen jälkeen (1). Aikana nukleotidin lisäksi, oikea saapuvat nukleotidin on sijoitettu tuottavaan linjaus katalyyttinen ryhmiä, varmistaa tehokas sisällyttämällä. Tämä linjaus varten katalyysi on herkkä vääristymiä kannan aiheuttamat virheelliset Watson-Crick base pariksi, jolloin liike-hiipumassa virheellisiä tai ei-sukulais emäsparia.,

Oikoluku DNA-Polymerases

Toinen tapa lisätä uskollisuus on polymeraasi on 3→5 exonuclease toimintaa, kutsutaan ”oikoluku”. Käyttämällä pohja-pariksi ja aktiivisen molekyyli tarkastuspisteitä edellä on kuvattu, Taq-DNA-polymeraasi on uskomattoman tarkka, mutta oikoluku entsyymejä voi olla jopa suurempi uskollisuus. Tämä ylimääräinen tarkkuus on kautta välitetty oikoluku, jossa polymeraasi ”tarkistaa” onko oikea nukleotidi on sisällytetty malliin., Jos havaitaan epäsuhta, DNA siirtyy polymeroitumisalueelta polymeraasin n-terminaaliin 3→5 eksonukleaasialueeseen. Väärin sisällytetty nukleotidi poistetaan, DNA siirtyy takaisin polymerointialueelle ja kopiointi voi jatkua (kuva 2).

Bakteriofagi T4 osoittautunut hyödylliseksi kokeellinen järjestelmä, arvioinnissa merkitystä 3→5 exonuclease toimintaa tarkkoja DNA: n replikaatio (6). T4-geenissä 43 (joka koodaa DNA-polymeraasia) havaittiin mutaatioita, jotka joko vähenivät tai lisäsivät uskollisuutta. Määrittelemällä exonuclease/polymeraasi (N/P) aktiivisuus-suhde mutantti-entsyymin todettiin, että polymeraasien kanssa alhainen N/P-suhteet olivat enemmän alttiita virheille kuin ne, joilla on korkea N/P-suhde., Selitys tämä havainto on että kun sisällyttämällä ristiriitaiset pohja se on enemmän todennäköistä, että exonuclease poistaa nukleotidin ennen polymeraasin toimintaa laajennetaan sen entsyymejä suuremmilla N/P-suhde. On kiinnostavaa, että polymeraasin oikoluku voi osoittaa sekvenssiriippuvuutta. Esimerkiksi AT-rikas sekvenssit ovat tehokkaammin oikoluku kuin GC alueilla. Tämä ristiriita on ajateltu johtuvan alemman vakautta alueilla helpottaa strand sulaminen ja siksi oikoluku toimintaa.,

3→5 eksonukleaasiaktiivisuuden puuttumisella voi olla muita seuraamuksia kuin uskollisuus PCR: ssä. Taq DNA-polymeraasin oikolukuaktiivisuuden puutetta on ehdotettu rajoittamaan ampliconin mahdollista kokoa tällä entsyymillä (7). Yleensä Taq toimii parhaiten, kun monistetaan DNA-fragmentit < 2 kb, ja voi työskennellä palasia jopa 3-4 kb. Kun pidetään tämän amplicon koko, Taq on vankka, helposti optimoitu entsyymi. Kuitenkin yli ~3 kb se laskee nopeasti tehokkuutta., Aikana PCR, Taq on misincorporate nukleotidit ja tuottaa epäsuhta, jossa se on altis viivyttely ja on todennäköisesti erottaa ennen ulottuu verrattuna oikein base pariksi 3 päättyy. Siksi, tietyn amplicon koko ja polymeraasi virhetaso tarpeeksi ristiriitaiset 3 päät voivat kerätä tehokkaasti inhiboivat PCR-prosessi. Nämä ristiriitaiset 3 päät ovat erityisen ongelmallisia Taq koska siitä puuttuu 3→5 exonuclease toimintaa poistaa ne., Lisäämällä pieneen määrään oikolukuentsyymiä, kuten Deep Vent®DNA polymeraasia, voidaan saavuttaa fragmenttien vahvistus ≥ 20 kb (kuva 3). Koska suurin osa entsyymin sekoitus on Taq-DNA-Polymeraasi se on luultavasti suurin osa primer-tiedostotunnistetta, kanssa oikoluku Syvä Aukko-polymeraasi poistaa estävä 3 epätasapaino syntyy Taq.,

– Polymeraasi Processivity

merkitystä oikoluku toimintaa PCR on laajalti tunnettu lähes kaksi vuosikymmentä, mutta toisen omaisuutta, processivity, on saanut enemmän huomiota., ”Processivity” on termi, joka viittaa useita nukleotidien sisällytetään polymeraasi yhteen sitova tapahtuma (ennen dissosiaatio). Taq DNA-polymeraasi lisää noin 50 nukleotidia sitoutumistapahtumaa kohti (8). Miksi tällä on väliä? Matalan processivity tai ”kauppa” – polymeraasi ulottuu väestöstä malleja huomattavasti eri tavalla kuin processive-polymeraasi. Erittäin kauppa-polymeraasi sitoutuu mallin, lisää pari nukleotidit, ja hajoaa, jättäen malleja, jotka voidaan laajentaa yhtä aikaa., Erittäin processiivinen polymeraasi sitoo mallipohjan ja ulottuu pitempiin sitoutumistapahtumiin.

– Se seuraa, että annetaan riittävästi aikaa tulos joko processive tai kauppa-polymeraasi reaktio olisi väestön kopioida malleja. Tietyissä olosuhteissa on kuitenkin mahdollista, että processiivisella polymeraasilla on ylivertainen suorituskyky. E. coli-polymeraasi III α-alayksikkö, osa tärkeimmistä replicative-polymeraasi, on processivity on < 10 emäsparia ja nopeus < 20 nukleotidit/sekunti (nt/s)., Kuitenkin, kun alayksikkö associates muiden replisome alayksiköstä, erityisesti liukuva puristin, tehokas processivity ja replikointi nopeus kasvaa > 50 kb ja 1 000 nt/s, vastaavasti (9). Termi ”tehokas processivity” käytetään, koska siellä on tietoa, joka osoittaa polymeraasin alayksikkö voi vaihtaa replisome, mutta replisome ylläpitää nopea, processive DNA: n replikaatio (10).

hyödyntää processivity PCR, tutkijat ovat fuusioitu DNA-binding domain on archaeal-polymeraasi (11)., Tämä kimeerinen entsyymi on useita parannettuja ominaisuuksia, mutta erityisesti se pystyy monistamaan DNA: n kanssa lyhyempi tiedostotunnistetta kertaa ja tuottaa pidempiä DNA-tuotteita tehokkaammin, mikä lyhentää yleistä thermocycling kertaa. Tämä fuusio ajatus on perusta Q5 High-Fidelity DNA-Polymeraasi ja Phusion® High-Fidelity DNA-Polymeraasi, kaksi-polymerases saatavilla NEB (Kuva 4).

Tulevaisuuden Suuntiin

Monet ominaisuudet vaikuttavat tehokkuus ja hyödyllisyys on PCR-polymeraasiketjureaktio. Polymeraasi active site arkkitehtuuri ja oikoluku toiminta vaikuttaa tarkkuus lopputuotteen. – Polymeraasi sekoituksia ja fuusio DNA-sitova proteiini antaa superior-PCR suorituskyvyn amplicon pituus ja, siinä tapauksessa, chimera, reaktio nopeus., Muita tärkeitä edistysaskeleita PCR, kuten hot-start-polymerases lisätä reaktion spesifisyys, multiplex-PCR (Kuva 5) ja qPCR on myös mullistanut biotieteiden.

osoituksena suunniteltu sekoituksia ja chimeras, ominaisuudet-polymeraasi itsessään voi olla moduloitu parantaa PCR suorituskykyä. Tulevaisuudessa on todennäköistä, että polymeraasiominaisuudet räätälöidään yhä enemmän tiettyihin PCR-sovelluksiin, ja näin ollen kyseessä on NEB: n tärkeä tutkimusalue.,

Näytä NEB: n DNA-Polymeraasi Valinta Kaavio