a pontos Genom replikáció kritikus bármely szervezet életképessége szempontjából. A DNS másolásának általános koncepciója nyilvánvaló volt a DNS kettős spirális szerkezetének tisztázása és a bázispár komplementaritásának azonosítása (1): A nukleobázisok egy szála szolgálhat egy új szál szintézisének sablonjaként. Egy évtizeden belül ezek a felfedezések, egy szer tisztítottuk E. coli katalizált DNS-szál duplikáció (2). Ezt az anyagot “polimeráznak”nevezték. E., coli DNS polimeráz i, az első DNS polimeráz felfedezett nem volt az elsődleges replikatív polimeráz, hanem az egyik részt lemaradó szál Okazaki fragmentum felbontás és a DNS-javítás. Ez előrevetítette számos DNS-polimeráz-család jövőbeli felfedezéseit, amelyek mindegyike specifikus sejtkövetelményeket szolgáltat a DNS replikációjára és javítására.

A DNS-polimerázok alapvető enzimekként szolgálnak az élettudományokban ugyanazon okból, hogy kritikusak a természetben:DNS-t másolnak. A polimeráz alkalmazások közé tartozik a DNS címkézés, szekvenálás és amplifikáció., Egy konkrét hangerősítő jegyzőkönyv, a polimeráz láncreakció (PCR) egy széles körben használt technika, amely foglalkoztat termofil polimeráz exponenciálisan felerősíti specifikus DNS szegmensek (3), valamint lehetővé teszi a különféle alkalmazások az emberi, illetve kórokozó diagnosztika molekuláris klónozás, a biológia labor szerte a világon.

Polimeráz Pontosság

PCR helyezi az alapvető igények egy polimeráz, mint egy sejt helyezi a klónozó rendszer. Lényegében a polimeráznak megbízhatónak, pontosnak és gyorsnak kell lennie., A polimeráz pontossága vagy a “hűség” arra a hajlamra utal, hogy a sablonszál által meghatározott megfelelő nukleotidot beépítik. A standard PCR enzimek nem meglepő módon nagyon pontosak. Még a Thermus aquaticus (Taq) DNS-polimeráz, amelyet alacsony hűségű PCR polimeráznak tekintünk, csak egyszer hibázik körülbelül nukleotid betoldásokban (12)., Polimeráz felfedezés, mérnöki erőfeszítések előállított hifi polimeráz, mely ritkán, hogy a bázis helyettesítő hibát, amely megköveteli, hogy a DNS szekvenálás módszerek olvasni millió szintetizált bázisok felismerni a hibákat, amelyeket a polimeráz Fejlesztések a mérési hűség által egyetlen molekula szekvenálás azonosította Q5® High-Fidelity DNS-Polimeráz, mint amelyek hűség 280X nagyobb thanTaq DNS-polimeráz (12).,

a Hűség pontok: geometriai kiválasztása az aktív site túl

DNS-polimeráz biztosítja a pontos replikáció segítségével egy sor molekuláris ellenőrző pontokon, a helyszínen nukleotid alapító, illetve azon túl, (1). A nukleotid hozzáadása során a megfelelő bejövő nukleotid a katalitikus csoportok produktív összehangolásához van elhelyezve, biztosítva a hatékony beépülést. Ez a katalízis igazítása érzékeny a helytelen Watson-Crick alappárosítás által okozott helyzettorzulásokra, lehetővé téve a kinetikus elakadást helytelen vagy nem rokon bázispároknál.,

DNS polimerázok lektorálása

a hűség növelésének másik módja, hogy a polimeráz 3→5 exonukleáz aktivitással rendelkezik, amelyet “lektorálásnak”neveznek. A bázispárosítás és az aktív hely molekuláris ellenőrző pontjainak felhasználásával a Taq DNS polimeráz hihetetlenül pontos, de a lektoráló enzimek még nagyobb hűséggel rendelkezhetnek. Ezt a további pontosságot lektorálással továbbítják, a polimeráz “ellenőrzi”, hogy a megfelelő nukleotid be van-e helyezve a sablonba., Ha eltérés észlelhető, a DNS a polimerizációs tartományból a polimeráz N-terminális 3→5 exonukleáz tartományába kerül. A helytelenül beépített nukleotid kivágásra kerül,a DNS visszakerül a polimerizációs tartományba, és a másolás folytatódhat (2.ábra).

a T4 bakteriofág hasznos kísérleti rendszernek bizonyult a 3→5 exonukleáz aktivitás fontosságának értékeléséhez a pontos DNS replikációhoz (6). A T4 gén 43 mutációit (amelyek a DNS-polimerázt kódolják) azonosították, amelyek vagy csökkentek, vagy megnövelték a hűséget. Egy mutáns enzim exonukleáz/polimeráz (N/P) aktivitási arányának meghatározásával megállapítást nyert, hogy az alacsony N/P arányú polimerázok nagyobb hibákra hajlamosak, mint a magas N/P arányok., Ennek a megfigyelésnek az a magyarázata, hogy egy nem megfelelő bázis beépítése esetén valószínűbb, hogy az exonukleáz eltávolítja a nukleotidot, mielőtt a polimeráz aktivitás kiterjeszti azt magasabb N/P arányú enzimekben. Érdekes, hogy a polimeráz lektorálási hatékonysága szekvenciafüggést mutathat. Például az AT-gazdag szekvenciák hatékonyabban korrektálódnak, mint a GC régiók. Úgy gondolják, hogy ez az eltérés az egyes régiók alacsonyabb stabilitásának köszönhető, amely megkönnyíti a szálak olvadását, ezért a lektorálási aktivitást.,

a 3→5 exonukleáz aktivitás hiánya a PCR-ben a hűség kivételével más következményekkel járhat. A Taq DNS-polimeráz lektorálási aktivitásának hiányát javasolták az amplicon méretének korlátozására ezzel az enzimmel (7). Általában a Taq akkor teljesít a legjobban, ha a < 2 kb-os DNS-fragmentumokat felerősíti, és akár 3-4 kb-os fragmensekkel is dolgozhat. Ha ezt az amplicon méretet tartjuk, a Taq egy robusztus, könnyen optimalizált enzim. Azonban ~3 kb felett gyorsan csökken a hatékonyság., A PCR során a Taq nem megfelelő nukleotidokat termel, és olyan eltéréseket hoz létre, amelyeknél hajlamos az elakadásra, és nagyobb valószínűséggel disszociál, mielőtt meghosszabbodik, mint a helyesen párosított 3 végekhez képest. Ezért egy bizonyos amplikonméretnél és polimeráz hibaaránynál elegendő 3 vég halmozódhat fel ahhoz, hogy hatékonyan gátolja a PCR folyamatot. Ezek a nem megfelelő 3 végek különösen problematikusak a Taq számára, mivel hiányzik a 3→5 exonukleáz aktivitás, hogy eltávolítsák őket., Kis mennyiségű lektoráló enzim, például a Deep Vent®DNS polimeráz hozzáadásával a fragmentumok ≥ 20 kb-os amplifikációja érhető el (3.ábra). Mivel a túlnyomó többsége az enzim a keverék Taq DNS polimeráz ez valószínűleg csinál a nagy részét a primer kiterjesztése, a lektorálás Deep Vent polimeráz eltávolítja a gátló 3 eltérések által generált Taq.,

polimeráz Processivity

a lektorálási tevékenység fontossága a PCR-re már közel két évtizede széles körben ismert, de egy másik tulajdonság, a processivity fokozott figyelmet kapott., A “Processivity” olyan kifejezés, amely a polimeráz által egyetlen kötési eseményben (disszociáció előtt) beépített nukleotidok számára utal. A Taq DNS-polimeráz kötési eseményenként körülbelül 50 nukleotidot ad hozzá (8). Miért számít ez? Az alacsony processivity vagy” distributive ” polimeráz jelentősen eltérő módon kiterjeszti a sablonok populációját, mint egy processive polimeráz. Egy erősen disztributív polimeráz kötődik egy sablonhoz, hozzáad néhány nukleotidot és disszociál, így a sablonok populációja idővel egyenlően meghosszabbítható., Egy erősen processzív polimeráz egy sablont köt össze, és hosszabb kötési eseményekkel bővül.

ebből következne, hogy elegendő idő elteltével a processzív vagy disztributív polimeráz reakció kimenetele másolt sablonok populációja lenne. Bizonyos körülmények között azonban lehetséges, hogy a processive polimeráz kiváló teljesítményt nyújt. Az E. coli polimeráz III α alegység, amely a fő replikatív polimeráz része, < 10 bázispár és < 20 nukleotid/másodperc (nt/s) sebességgel rendelkezik., Ha azonban az alegység a többi replisome alegységgel, különösen a csúszó bilincsrel társul, a tényleges processivitás és replikációs sebesség > 50 kb, illetve 1000 nt/s értékre növekszik (9). A “hatékony processivitás” kifejezést azért használják, mert vannak olyan adatok, amelyek azt jelzik, hogy a polimeráz alegység képes kicserélni a repliszómát, de a repliszóma gyors, processív DNS-replikációt tart fenn (10).

a PCR processivitásának kihasználása érdekében a kutatók DNS-kötő domént kapcsoltak össze egy archaeális polimerázzal (11)., Ez a kiméra enzim számos javított tulajdonsággal rendelkezik, de különösen képes a DNS-t rövidebb kiterjesztési idővel felerősíteni, és hosszabb DNS-termékeket hatékonyabban előállítani, ezáltal lerövidítve az Általános termocikling időket. Ez a fúziós ötlet a Q5 High-Fidelity DNS polimeráz és Phusion® High-Fidelity DNS polimeráz alapja, két NEB-ből álló polimeráz (4.ábra).

Future Directions

számos tulajdonság befolyásolja a PCR polimeráz hatékonyságát és hasznosságát. A polimeráz aktív hely architektúrája és a lektorálási aktivitás befolyásolja a végtermék pontosságát. A polimeráz-keverékek és a DNS-kötő fehérjéhez való fúzió jobb PCR teljesítményt biztosít az amplicon hosszához és a kiméra esetében a reakciósebességhez., Más fontos előrelépések a PCR-ben, mint például a hot-start polimerázok a reakció specifikusságának növelése érdekében, a multiplex PCR (5. Ábra) és a qPCR forradalmasították az élettudományokat is.

amint azt a mesterséges keverékek és kimérák is bizonyítják, maga a polimeráz tulajdonságai modulálhatók a PCR teljesítményének javítása érdekében. A jövőben valószínű, hogy a polimeráz tulajdonságait egyre inkább egyedi PCR alkalmazásokhoz igazítják, és mint ilyen, ez a NEB egyik fontos kutatási területe.,

NEB DNS-polimeráz kiválasztási diagramjának megtekintése