következő generációs szekvenálás

Bevezetés

az emberi genom szekvenálása 2003-ban fejeződött be, 13 éves nemzetközi együttműködés és 3 milliárd dolláros beruházás után. Az emberi genom projekt a Sanger szekvenálást (bár erősen optimalizált), a DNS szekvenálás fő módszerét alkalmazta az 1970-es évek találmánya óta.

ma a szekvenálás iránti igény exponenciálisan növekszik, nagy mennyiségű genomikus DNS-t gyorsan, olcsón és pontosan kell elemezni., Az új szekvenálási technológiáknak köszönhetően, amelyeket együttesen következő generációs szekvenálásnak neveznek, most már lehetséges egy teljes emberi genom szekvenálása néhány óra alatt.

Sanger szekvenálás és Következő generációs szekvenálás

a következő generációs szekvenálás (NGS) elve hasonló a Sanger szekvenáláshoz, amely kapilláris elektroforézisre támaszkodik. A genomikus szál töredezett, és az egyes fragmentumok bázisait a kibocsátott jelek azonosítják, amikor a fragmentumokat egy sablonszálhoz kötik.,
A Sanger módszer szükséges külön lépés sorozatot, elválás (elektroforézis), érzékelés, ami megnehezíti, hogy automatizálják a minta előkészítése volt korlátozott forgalmú, skálázhatóság, valamint állásfoglalás. A NGS módszer tömb-alapú sorozatot, amely egyesíti a technika fejlődésével a Sanger szekvenálás, hogy a folyamat több millió reakciók párhuzamosan, ami nagyon nagy a sebesség, kapacitás csökkentett áron., A genom szekvenálás projektek, amelyek sok év kellett hozzá, a Sanger módszerekkel lehet kitölteni óra NGS, bár rövidebb olvassa el hosszúságú (a szám a bázisok szekvenált egy időben), valamint kevesebb pontossággal.,

a Következő generációs módszerek a DNS szekvenálás három általános lépéseket:

• Könyvtár elkészítése: a könyvtárak felhasználásával készül random töredezettség DNS-t, majd lekötésével egyéni linkers
• Erősítés: a könyvtár erősített segítségével klonális amplifikációs módszerek PCR
• Szekvenálás: DNS szekvenált segítségével több különböző megközelítések

Könyvtár készítmény

Először is, a DNS töredezett vagy enzimesen vagy sonication (a gerjesztő ultrahang segítségével), hogy hozzon létre kisebb szál., Az adaptereket (rövid, kettős szálú szintetikus DNS-darabokat) ezután a DNS-ligáz, egy DNS-szálakhoz csatlakozó enzim segítségével ligálják ezekhez a fragmensekhez. Az adapterek lehetővé teszik, hogy a szekvencia egy kiegészítő partnerhez kötődjön.

Konvertert, vagy szintetizált úgy, hogy egyik vége a ‘ragad’, míg a másik a ‘nyers’ (nem egységes), azzal a céllal, hogy csatlakozik a tompa végén a tompa végű DNS-t. Ez a molekulák közötti bázispárosítás potenciális problémájához vezethet, ezért a dimerképződés., Ennek megakadályozása érdekében a DNS kémiai szerkezetét hasznosítják, mivel a ligálás a 3′-OH és 5′-p végek között történik. A foszfát eltávolításával az adapter ragadós végéből, ezért ehelyett 5′-OH vég létrehozásával a DNS-ligáz nem képes hidat képezni a két termini között (1.ábra).,

ahhoz, hogy A szekvenálás, hogy sikeres legyen, a könyvtár töredékek kell térben csoportosulnak PCR kolóniák vagy ‘polonies’ mint ők hagyományosan ismert, melynek keretében sok példányban egy adott könyvtár töredék. Mivel ezek a polóniák sík módon vannak rögzítve, a tömb jellemzői párhuzamosan enzimatikus módon manipulálhatók. Ez a módszer a könyvtárépítés sokkal gyorsabb, mint a korábbi munkaigényes eljárás kolónia szedés és E., a DNS izolálására és erősítésére használt coli klónozás a Sanger szekvenáláshoz azonban ez a fragmensek olvasási hosszának rovására történik.

erősítés

Könyvtárerősítés szükséges, hogy a szekvenszerből vett jel elég erős legyen ahhoz, hogy pontosan kimutatható legyen. Az enzimatikus amplifikációval olyan jelenségek fordulhatnak elő, mint a “biasing” és a “duplikáció”, amelyek bizonyos könyvtártöredékek preferenciális amplifikációjához vezetnek. Ehelyett többféle amplifikációs folyamat létezik, amelyek PCR-t használnak nagyszámú DNS-klaszter létrehozásához.,

emulziós PCR

emulziós olajat, gyöngyöket, PCR keveréket és a könyvtár DNS-ét összekeverjük, hogy emulziót képezzünk, amely mikro kutak kialakulásához vezet (2.ábra).

ahhoz, hogy a sorozatot, hogy a folyamat sikeres legyen, minden micro hát tartalmaznia kell egy gyöngy, egy DNS (mintegy 15% – a mikro kutak ez a kompozíció). A PCR ezután denaturálja a könyvtár fragmentumát, amely két különálló szálat vezet, amelyek közül az egyik (a fordított szál) elfedi a gyöngyöt., A lágyított DNS-t polimeráz erősíti, a gyöngytől a primer hely felé. Az eredeti fordított szál ezután denaturálódik, majd csak a gyöngyből szabadul fel, hogy újra lágyuljon a gyöngyre, hogy két különálló szálat adjon. Ezek mind felerősödnek, hogy két DNS-szálat kapjanak a gyöngyhöz. A folyamatot ezután 30-60 cikluson keresztül ismételjük meg, ami DNS-klaszterekhez vezet. Ezt a technikát időigényes jellege miatt kritizálták, mivel számos lépést igényel (az emulzió kialakítása és törése, PCR erősítés, dúsítás stb.), Annak ellenére, hogy számos NGS platformon széles körben használják., Ez is viszonylag hatékony, mivel csak mintegy kétharmada az emulziós mikro reaktorok ténylegesen tartalmaz egy gyöngy. Ezért további lépésekre van szükség az üres rendszerek elválasztásához, ami több potenciális pontatlansághoz vezet.

híd PCR

az áramlási sejt felülete sűrűn bevonva van olyan primerekkel, amelyek kiegészítik a DNS-könyvtár fragmensekhez csatolt primereket (3.ábra). A DNS-t ezután véletlenszerűen a sejt felületéhez rögzítik, ahol polimeráz-alapú kiterjesztés reagenseinek vannak kitéve., Nukleotidok és enzimek hozzáadásával a DNS egyes szálainak szabad végei egymást kiegészítő primereken keresztül kapcsolódnak a sejt felszínéhez, áthidalt struktúrákat hozva létre. Az enzimek ezután kölcsönhatásba lépnek a hidakkal, hogy kettős szálúvá váljanak, így amikor a denaturáció megtörténik, két egyszálú DNS-fragmens kapcsolódik a felülethez közel. Ennek a folyamatnak az ismétlése lokalizált azonos szálak klonális klasztereihez vezet. A klaszter sűrűségének optimalizálása érdekében a reagensek koncentrációját nagyon szorosan ellenőrizni kell a túlzsúfoltság elkerülése érdekében.,

szekvenálás

a következő generációs szekvenálás számos versengő módját fejlesztették ki különböző vállalatok.

454 Pyrosequencing

a Pirosequencing a “szintézis szerinti szekvenálás” elven alapul, ahol egy kiegészítő szálat polimeráz enzim jelenlétében szintetizálnak (4.ábra). Ellentétben a didoxinukleotidok alkalmazásával a lánc amplifikációjának megszüntetésére (mint a Sanger szekvenálásnál), a piroszekvenálás ehelyett a pirofoszfát felszabadulását érzékeli, amikor nukleotidokat adnak a DNS-lánchoz., Kezdetben az emulziós PCR technikát használja a szekvenáláshoz szükséges polóniák felépítéséhez, majd eltávolítja a kiegészítő szálat. Ezután egy ssDNA szekvenáló primer hibridizálódik a szál végére (primer-kötő régió), majd a négy különböző dntp-t egymás után hajtják végre, hogy a polóniák feletti kutakból be-ki áramoljanak. Ha a megfelelő dNTP enzimatikus módon be van építve a szálba, akkor pirofoszfát felszabadulását okozza. ATP-szulfuriláz és adenozin jelenlétében a pirofoszfát ATP-ként alakul át., Ezt az ATP molekulát a luciferáz-katalizált luciferin oxiluciferinné történő átalakítására használják, amely fényt termel, amelyet kamerával lehet kimutatni. A fény relatív intenzitása arányos a hozzáadott bázis mennyiségével (azaz az intenzitás kétszeresének csúcsa azt jelzi, hogy egymás után két azonos bázist adtak hozzá).,

A 454 Élettudomány által kifejlesztett Piroszekvenálás a következő generációs szekvenálás egyik korai sikere volt; valójában 454 Élettudomány állította elő az első kereskedelmi forgalomban kapható következő generációs szekvenszert. A módszert azonban más technológiák is háttérbe szorították, és 2013-ban az új tulajdonosok, Roche 454 Élettudomány bezárását és a 454 piroszekvenáló platform megszüntetését jelentették be.,

Ion torrent félvezető szekvencia

Ion torrent sorozatot használ egy “szekvenálás szintézis által” megközelítés, amelyben egy új DNS szál, kiegészíti a cél strand, a szintetizált egy bázis, egy időben. A félvezető chip érzékeli a DNS-polimerizáció során keletkező hidrogénionokat (5.ábra).

az emulziós PCR-t használó polonképződést követően a DNS-könyvtár fragmentumot egymás után elárasztják minden nukleozid-trifoszfáttal (dNTP), mint a piroszekvenálásnál. A dNTP-t ezután beépítik az új szálba, ha kiegészítik a célszálon lévő nukleotidot., Minden egyes nukleotid sikeres hozzáadásakor hidrogénion szabadul fel, amelyet a szekvenszer pH-érzékelője érzékel. A piroszekvenálási módszerhez hasonlóan, ha ugyanazon nukleotid közül egynél többet adnak hozzá, a pH/jel intenzitásának változása ennek megfelelően nagyobb.

Ion torrent sorrend az első kereskedelmi technika, hogy nem használja fluoreszcencia, valamint a kamera beolvasása; ezért gyorsabb, olcsóbb, mint sok más módszerek., Sajnos nehéz lehet felsorolni az egymás után hozzáadott azonos bázisok számát. Például nehéz lehet megkülönböztetni a pH-változást a 9 hosszúságú homorepeat esetében a 10 hosszúság egyikéhez, ami megnehezíti az ismétlődő szekvenciák dekódolását.

szekvenálás ligálással (szilárd)

a szilárd anyag egy enzimatikus szekvenálási módszer, amely a DNS-ligázt, a biotechnológiában széles körben használt enzimet használja a kettős szálú DNS-szálak ligálására (6.ábra)., Emulzió a PCR-t egy olyan ssdna primer kötő régió (más néven adapter) immobilizálására/erősítésére használják, amelyet a célszekvenciához (azaz a szekvenálandó szekvenciához) konjugáltak egy gyöngyön. Ezeket a gyöngyöket ezután üvegfelületre helyezzük-nagy sűrűségű gyöngyök érhetők el, amelyek viszont növelik a technika teljesítményét. Egyszer gyöngy meghallgatás történt, primer hossza N keresztez, hogy az adaptert, akkor a gyöngyök vannak téve a könyvtár 8-mer szondák, amelyek különböző fluoreszcens festékkel a 5′ végén pedig egy hidroxil-csoport, a 3′ vég., Az 1 és 2 bázisok kiegészítik a szekvenálandó nukleotidokat, míg a 3-5 bázisok degeneráltak, a 6-8 bázisok pedig inozin bázisok. Csak egy kiegészítő szonda hibridizálódik a célsorozathoz, a primer mellett. A DNS-ligáz ezután csatlakozik a 8-mer szondához az alapozóhoz. Az 5-ös és 6-os bázisok közötti foszforotioát kapcsolat lehetővé teszi, hogy a fluoreszkáló festéket ezüstionokkal hasítsák ki a fragmentumból., Ez a hasítás lehetővé teszi a fluoreszcencia mérését (négy különböző fluoreszkáló színezéket használnak, amelyek mindegyike eltérő kibocsátási spektrummal rendelkezik), valamint létrehoz egy 5′-foszfát csoportot, amely további ligáláson megy keresztül. Miután a szekvenálás első fordulója befejeződött, a hosszabbító terméket megolvasztják, majd a szekvenálás második fordulóját egy n−1 hosszúságú alapozóval tökéletesítik. A szekvenálás számos fordulója rövidebb primerekkel minden alkalommal (azaz N−2, N−3 stb.), valamint a fluoreszcencia mérése biztosítja a cél szekvenálását.,

Köszönhető, hogy a két-bázis szekvenálási módszer (mivel minden bázis hatékonyan szekvenált kétszer), a Szilárd technika nagyon pontos (a 99.999% – os hatodik alapozó, a legpontosabb a második generációs platformok), valamint olcsó. 7 nap alatt képes egyetlen futást befejezni, ekkor pedig 30 Gb adatot képes előállítani. Sajnos fő hátránya, hogy az olvasási hossz rövid, így sok alkalmazáshoz nem alkalmas.,

Megfordítható terminátor sorozatot (Illumina)

Megfordítható terminátor sorozatot, hogy eltér a hagyományos Sanger módszer az, hogy ahelyett, hogy megszüntetéséről alapozó kiterjesztését visszafordíthatatlanul segítségével dideoxynucleotide, módosított nukleotid használják reverzibilis megszüntetését. Míg sok más technika emulziós PCR-t használ a DNS-könyvtár fragmensek erősítésére, a reverzibilis termináció híd PCR-t használ, javítva a folyamat ezen szakaszának hatékonyságát.,

a reverzibilis terminátorok két kategóriába sorolhatók: 3′-O-blokkolt reverzibilis terminátorok és 3′-unblocked reverzibilis terminátorok.

3 ‘ – O-blokkolt reverzibilis terminátorok

a mechanizmus szekvenálást alkalmaz szintézis megközelítéssel, az alapozó fokozatos megnyújtásával. Először is, a szekvenáló alapozók és sablonok szilárd tartóhoz vannak rögzítve. A tartóelem a négy DNS-bázis mindegyikének van kitéve, amelyek egy 3′-O-azidometilcsoport mellett más fluorofórral (a nitrogénbázishoz) vannak rögzítve (7.ábra).,

Csak a megfelelő bázis anneals a cél, majd ezt követően elkötve, hogy az alapozó. A szilárd támogatást, akkor rajzolódik meg nukleotidok, hogy nem került be elmossa az eső, a fluoreszkáló ágra hasított segítségével TCEP (tris(2-carboxyethyl)foszfin). A TCEP eltávolítja a 3′-O-azidometil csoportot is, regenerálja a 3 ‘ – OH-t, és a ciklus megismételhető (8 .ábra).,

3′-eltakarva reverzibilis terminátorok

A reverzibilis felmondás csoport 3′-eltakarva reverzibilis terminátorok kapcsolódik mind a bázis -, mind a fluoreszcencia csoport, ami most működik, mint egy része a felmondás csoport, valamint egy riporter. Ez a módszer háromféleképpen különbözik a 3′-O-blokkolt reverzibilis terminátorok módszerétől: először is, a 3 ‘ – pozíció nincs blokkolva (azaz, a bázis szabad 3 ‘ – OH); a fluorofor ugyanaz mind a négy bázis; és minden módosított bázis folyik egymás helyett ugyanabban az időben.

ezeknek a technikáknak a fő hátránya a rossz olvasási hosszuk, amelyet a két jelenség egyike okozhat. Annak érdekében, hogy megakadályozzuk a két nukleotid egyetlen lépésben történő beépítését, egy blokkot helyezünk el, azonban ha a gyenge szintézis miatt nincs blokk-kiegészítés, a szálak a fázisból kiléphetnek, ami zajt hoz létre, amely korlátozza az olvasási hosszt. Zaj is létrehozható, ha a fluorofor sikertelenül csatlakozik vagy eltávolításra kerül., Ezek a problémák más szekvenálási módszerekben is elterjedtek, és az olvasási hossz fő korlátozó tényezői.

ezt a technikát az Illumina vezette be, a HiSeq és MiSeq platformokkal. A HiSeq a legolcsóbb a második generációs szekvenátorok közül, millió dolláros költséggel. Ez is egy nagy adatteljesítmény 600 Gb per futás, amely körülbelül 8 napig tart, hogy teljes.

harmadik generációs szekvenálás

a technikák új kohorszát azóta egyetlen molekula szekvenálással és egyszeri valós idejű szekvenálással fejlesztették ki, megszüntetve a klonális amplifikáció szükségességét., Ez csökkenti a PCR által okozott hibákat, egyszerűsíti a könyvtár előkészítését, és ami a legfontosabb, sokkal nagyobb olvasási hosszúságot biztosít a nagyobb átviteli sebességű platformok használatával. Példák Csendes-óceáni Biosciences’ platform, amely használja a SMRT (egyetlen molekula valós időben) szekvenálás adni olvassa el hossza mintegy ezer bázisok, valamint Helicos Biosciences, amely úgynevezett egyetlen molekula sorozatot, ezért nem igényel erősítés előtt szekvenálás. Az Oxford Nanopore Technologies jelenleg szilícium alapú nanopórákat fejleszt, amelyek olyan áramnak vannak kitéve, amely megváltozik, amikor a DNS áthalad a póruson., Ez várhatóan nagy áteresztőképességű gyors módszer a DNS-szekvenálásra, bár először foglalkozni kell olyan problémákkal, mint például a póruson keresztüli szállítás lelassulása.

epigenetikai módosítások szekvenálása

ahogy a következő generációs szekvenálás lehetővé tette a genomikus szekvenálást hatalmas léptékben, a közelmúltban világossá vált, hogy a genetikai kód nem tartalmazza az organizmusok által szükséges összes információt. A DNS-bázisok, különösen az 5-metilcytozin epigenetikus módosításai szintén fontos információkat szolgáltatnak.,

az összes második generációs szekvenálási platform, mint a Sanger szekvenálás, a PCR-től függ, ezért nem képes szekvenciálni a módosított DNS-bázisokat. Valójában mind az 5-metilcitozint, mind az 5-hidroxi-metil-citozint a PCR-ben részt vevő enzimek citozinként kezelik; ezért az epigenetikai információk elvesznek a szekvenálás során.,

biszulfit szekvenálás

a biszulfit szekvenálás kihasználja a citozin és az 5-metilcitozin reaktivitásának különbségét a biszulfit tekintetében: a citozint a biszulfit dezaminálja uracil (amely szekvenáláskor T-ként szól), míg az 5-metilcitozin nem aktív (azaz C). Ha két szekvenálási folyamatot párhuzamosan végzünk, egyet biszulfitkezeléssel, egyet pedig anélkül, a két Futtatás kimenetei közötti különbségek az eredeti szekvenciában metilált citozinokat jeleznek., Ez a technika dsDNA-ra is alkalmazható, mivel a biszulfit-kezelés után a szálak már nem kiegészítik egymást, ssDNA-ként kezelhetők.

5-hidroxi-metil-Cytozin, egy másik fontos epigenetikai módosítás, reagál a biszulfittal, hogy citozin-5-metilszulfonátot képezzen(amely szekvenáláskor C-ként szól). Ez némileg bonyolítja a dolgokat, és azt jelenti, hogy a biszulfit szekvenálás önmagában nem használható a metiláció valódi indikátoraként.,

oxidatív biszulfit szekvenálás

az oxidatív biszulfit szekvenálás kémiai oxidációs lépést eredményez, amely az 5-hidroxi-metil-cytozint 5-formil-cytozinná alakítja kálium-perrutenát, KRuO4 alkalmazásával, a biszulfit kezelés előtt. Az 5-formil-Cytozin deformálódik és dezaminálódik, hogy biszulfit-kezeléssel uracil alakuljon ki. A citozin, az 5-metilcitozin és az 5-hidroximetilcitozin megkülönböztetéséhez most három külön szekvenálási folyamatra van szükség (lásd a 9.ábrát).,

a következő generációs szekvenálás alkalmazása lehetővé tette a kutatók számára, hogy hatalmas mennyiségű genomikus szekvenálási adatot gyűjtsenek., Ennek a technológiának számos alkalmazása van, mint például: komplex betegségek diagnosztizálása és megértése; teljes genom szekvenálás; epigenetikai módosítások elemzése; mitokondriális szekvenálás; transzkriptóm szekvenálás-annak megértése, hogy a genetikai változatok megváltozott expressziója hogyan befolyásolja a szervezetet; és exome szekvenálás − az exome mutációi úgy gondolják, hogy az emberi genomban a mutációk akár 90% − át is tartalmazzák, ami betegséghez vezet., DNS-technikákat alkalmaztak bizonyos betegségekért felelős gének azonosítására és izolálására, valamint a “génterápia” néven ismert hibás gén helyes másolatának biztosítására.

a génterápia nagy fókuszterülete a rákkezelés – az egyik lehetséges módszer egy antiszenzív RNS (amely kifejezetten megakadályozza a célzott fehérje szintézisét) bevezetése az onkogénbe, amely tumorsejtek kialakulásához vezet. Egy másik módszer az úgynevezett “öngyilkos génterápia”, amely géneket vezet be a rákos sejtek szelektív elpusztítására., A toxikus fehérjék és enzimek számos genetikai kódja ismert, és ezeknek a géneknek a tumorsejtekbe történő bevezetése sejthalálhoz vezetne. Ennek a módszernek az a nehézsége, hogy nagyon pontos szállítási rendszert biztosítson az egészséges sejtek elpusztításának megakadályozására.
Ezek a módszerek által lehetővé tett szekvencia elemzése daganat genom szekvenciát jelent, amely lehetővé teszi, orvosi szakértők szabó kemoterápia, illetve más, a rák kezelések hatékonyabban, hogy a betegek egyedi genetikai összetétele, forradalmasítja a diagnosztikai szakaszában a személyre szabott orvoslás.,

mivel a DNS-szekvenálás költsége csökken, elterjedtebbé válik, ami számos kérdést vet fel. A szekvenálás hatalmas mennyiségű adatot termel, és az adatok feldolgozásával és tárolásával kapcsolatban számos számítási kihívás áll fenn. Vannak olyan etikai kérdések is, mint például az egyén DNS-ének tulajdonjoga, amikor a DNS-t szekvenálják. A DNS-szekvenálási adatokat biztonságosan kell tárolni, mivel aggodalomra ad okot, hogy a biztosítási csoportok, a jelzálog-brókerek és a munkáltatók ezeket az adatokat felhasználhatják a biztosítási árajánlatok módosítására vagy a jelöltek közötti megkülönböztetésre., A szekvenálás segíthet annak megállapításában is, hogy az egyénnek fokozott kockázata van-e egy adott betegségre, de a beteg tájékoztatása vagy a betegség gyógyítása egy másik kérdés.

Ahmadian, A.; Svahn, H.; masszívan párhuzamos. Szekvenáló platformok segítségével Lab egy Chip technológiák. Labor Chip, 11, 2653 − 2655 (2011).

Balasubramanian, S.; nukleinsavak szekvenálása: a kémiától az orvostudományig. Chem. Commun. 47, 7281 − 7286 (2011).

Mardis, E.; következő generációs DNS szekvenálási módszerek. Annu. Genomics Hum Rev. Genet. 9, 387 − 402 (2008).

Mardis, E.,; Következő generációs DNS szekvenáló platformok. Annu. Rev. Anal. Chem. 6, 287-303 (2013).

Shendure, J.; Ji, H.; következő generációs DNS szekvenálás. Nat. Biotechnológia. 26, 10 1135-1144 (2008).

Lásd még:

ingyenes Online nukleinsav-könyvünk információkat tartalmaz a nukleinsavak kémiai és biológiai vonatkozásairól.