számos biológiai alkalmazás, például mikrobiológia, sejttenyészet, vérmunka és sok más, a sejteket használó, megköveteli, hogy meghatározzuk a sejtkoncentrációt kísérletünkhöz.

A Sejtszámolás meglehetősen egyszerű, és egy hemocitométernek nevezett számlálókamrát igényel, amelyet a 19. századi francia anatómus, Louis-Charles Malassez talált ki a vérsejtszám elvégzésére. A hemocitométer vastag üvegmikroszkóp csúszdából áll, középen merőleges vonalak rácsával., A rács olyan méreteket határozott meg, hogy a vonalak által lefedett terület ismert legyen, ami lehetővé teszi a cellák számának kiszámítását egy adott oldatmennyiségben.

1.ábra. A klasszikus Hemocitométer

a hemocitométer leggyakoribb típusa középen” H ” alakú gravírozással rendelkezik, amely két különálló tükörszerű polírozott rácsfelületet tartalmaz ,és biztosítja a fedél csúszási rögzítési területét (1.ábra).,

Betöltése a hemocytometer

megkezdése Előtt ellenőrizzük, hogy mind a hemocytometer, illetve annak lefedő tiszta eltávolításával minden por részecskék objektívtisztítóval. A hemocitométerekre történő szereléshez használt burkolatok kifejezetten vastagabbak, mint a hagyományos mikroszkópos burkolatok, mivel képesnek kell lenniük egy csepp folyadék felületi feszültségének leküzdésére.

győződjön meg róla, hogy a cella szuszpenzió betöltése előtt először helyezze a fedőlapot a számlálási felületre., Ezután helyezze a pipetta hegyét a mintával az egyik v alakú kútba, mint a 2. ábrán, majd óvatosan távolítsa el a mintát. A fedél alatt lévő területlip kitölti a kapilláris hatást. Elegendő folyadékot kell bevinni úgy, hogy a tükrözött felület csak lefedje, általában körülbelül 10 µl, de ne töltse túl a felületet. Két mintát tölthet be egy hemocitométerre, egyet a két rács mindegyikébe.

2.ábra., A Hemocitométer betöltése

a betöltött hemocitométert ezután a mikroszkóp színpadára helyezzük, majd a számláló rácsot kis teljesítmény mellett fókuszba helyezzük. Hagyja, hogy a minta néhány percig leülepedjen, és ne mozgassa a fedőlapot, mivel ez légbuborékokat okozhat, és megnehezítheti a számolást.

sejtek számlálása hemocitométerben

a hemocitométeren lévő teljes rács kilenc négyzetet tartalmaz, amelyek mindegyike 1 mm2 (3.ábra). A hemocitométer központi számlálási területe (3b ábra) 25 nagy négyzetet tartalmaz, minden nagy négyzetnek 16 kisebb négyzete van., Számláláskor csak azokat a sejteket számolja a nagy négyzet két oldalának vonalán, hogy elkerülje a sejtek kétszer történő számlálását (3G ábra). A szuszpenziókat annyira fel kell hígítani, hogy a sejtek vagy más részecskék ne fedjék egymást a rácson, és egyenletesen oszlanak el.

3.ábra. A sejtek számlálása a Hemocitométeren.

az elhalt és életképes sejtek megkülönböztetése érdekében a mintát gyakran hígítják egy adott folttal, például a Trypan kékkel., Ez a festési módszer, más néven festékkizárási festés, diazo festéket használ, amely szelektíven behatol az elhalt sejtek sejtmembránjaiba, kék színezéssel, míg az élő sejtek membránjai nem szívódnak fel, így kizárva az élő sejteket a festésből. Mikroszkóp alatt nézve az elhalt sejtek sötétkékként jelennek meg (4.ábra)

4. ábra. Az élő sejtek Trypan Kék kizárása A Hemocitométeren. (A nyíl jelzi a festék felvételét az elhalt sejtek membránján.,)

a gróf végrehajtásához meg kell határozni a kívánt sejttípus felismeréséhez szükséges nagyítást, és szisztematikusan számolni kell a cellákat a kiválasztott négyzetekben, hogy a teljes szám körülbelül 100 sejt legyen, a statisztikailag szignifikáns számhoz szükséges sejtek minimális száma.

nagy cellák esetén egyszerűen megszámolhatja a cellákat a négy nagy sarok négyzeten belül (3C-F ábra), a középső pedig (3b ábra). A kis cellák sűrű szuszpenziójához érdemes megszámolni a cellákat a központi négyzet négy külső és középső négyzetében (3b ábra), vagy hígabb szuszpenziót készíteni.,

ne feledje, ha egy cella átfedésben van egy döntéssel, számolja “in” – nek, ha átfedi a felső vagy a jobb oldali uralkodást, és “ki”, ha átfedi az alsó vagy a bal oldali uralkodást (3G ábra).

a középső terület (3b Ábra) és minden sarok négyzet (3C-F ábra) 1 mm x 1 mm = 1 mm2: az egyes négyzetek mélysége 0,1 mm.az egyes négyzetek végső térfogata ebben a mélységben 100NL.,

ha Egyszer megszerezték a teljes sejtszám, sejt koncentráció kiszámítása a következő képlet adja meg:

Így például, ha a hígított minta 1:1 Trypan kék, te jelezni 325 sejtek a 4 sarokban négyzet plusz a központi nagy téren, teljes sejt / ml =

Ha meg szeretné tudni, hogy hány sejtek az eredeti minta, csak szaporodnak a sejt koncentráció a teljes minta mennyisége. Például, ha az eredeti minta térfogata 5 ml, akkor a minta Teljes =