Molte applicazioni biologiche come la microbiologia, la coltura cellulare, il lavoro del sangue e molte altre che utilizzano le cellule richiedono che determiniamo la concentrazione cellulare per il nostro esperimento.

Il conteggio delle cellule è piuttosto semplice e richiede una camera di conteggio chiamata emocitometro, un dispositivo inventato dall’anatomista francese Louis-Charles Malassez del 19 ° secolo per eseguire il conteggio delle cellule del sangue. Un emocitometro è costituito da uno spesso vetrino da microscopio con una griglia di linee perpendicolari incise nel mezzo., La griglia ha dimensioni specificate in modo che l’area coperta dalle linee sia nota, il che rende possibile contare il numero di celle in un volume specifico di soluzione.

Figura 1. Un emocitometro classico

Il tipo più comune di emocitometro ha una forma ad “H” incisa al centro che racchiude due superfici a griglia lucidate a specchio separate e fornisce l’area di montaggio del coperchio (Figura 1).,

Caricare l’emocitometro

Prima di iniziare assicurarsi che sia l’emocitometro che il suo coprioggetto siano puliti rimuovendo eventuali particelle di polvere con carta per lenti. Coverslips che vengono utilizzati per il montaggio su hemocytometers sono appositamente realizzati per essere più spessi rispetto ai coverslips microscopia convenzionali perché devono essere in grado di superare la tensione superficiale di una goccia di liquido.

Assicurarsi di posizionare il coprioggetti sulla superficie di conteggio prima di caricare la sospensione della cella., Quindi posizionare la punta della pipetta con il campione in uno dei pozzetti a forma di V, come in Figura 2, ed espellere delicatamente il campione. L’area sotto il coprioggetto si riempie per azione capillare. Dovrebbe essere introdotto abbastanza liquido in modo che la superficie specchiata sia appena coperta, di solito intorno a 10 µl, ma non riempire eccessivamente la superficie. È possibile caricare due campioni su un emocitometro, uno in ciascuna delle due griglie.

Figura 2., Caricamento dell’emocitometro

L’emocitometro caricato viene quindi posizionato sul palco del microscopio e la griglia di conteggio viene messa a fuoco a bassa potenza. Lasciare che il campione si depositi per un paio di minuti ed evitare di spostare il coprioggetto in quanto potrebbe introdurre bolle d’aria e rendere difficile il conteggio.

Conteggio delle celle in un emocitometro

La griglia completa su un emocitometro contiene nove quadrati, ognuno dei quali è di 1 mm2 (Figura 3). L’area centrale di conteggio dell’emocitometro (Figura 3B) contiene 25 quadrati grandi e ogni quadrato grande ha 16 quadrati più piccoli., Quando si conta, contare solo quelle celle sulle linee di due lati del quadrato grande per evitare di contare le celle due volte (Figura 3G). Le sospensioni dovrebbero essere abbastanza diluite in modo che le cellule o altre particelle non si sovrappongano l’una all’altra sulla griglia e dovrebbero essere distribuite uniformemente.

Figura 3. Conteggio delle cellule sull’emocitometro.

Per distinguere tra cellule morte e vitali, il campione viene spesso diluito con una macchia particolare, come il blu di tripano., Questo metodo di colorazione, noto anche come colorazione di esclusione del colorante, utilizza un colorante diazo che penetra selettivamente le membrane cellulari delle cellule morte, colorandole di blu, mentre non viene assorbito dalle membrane delle cellule vive, escludendo così le cellule vive dalla colorazione. Se viste al microscopio, le cellule morte appaiono come blu scuro (Figura 4)

Figura 4. Trypan Esclusione blu di cellule vive sull’emocitometro. (Freccia indica l’assorbimento di colorante attraverso la membrana delle cellule morte.,)

Per eseguire il conteggio, determinare l’ingrandimento necessario per riconoscere il tipo di cella desiderato e contare sistematicamente le celle nei quadrati selezionati in modo che il conteggio totale sia di circa 100 celle, un numero minimo di celle necessario per un conteggio statisticamente significativo.

Per le celle di grandi dimensioni, puoi semplicemente contare le celle all’interno dei quattro grandi quadrati angolari (Figura 3C-F) e quello centrale (Figura 3B). Per una sospensione densa di piccole cellule si potrebbe desiderare di contare le cellule nei quattro quadrati esterni e centrali del quadrato centrale (Figura 3B) o fare una sospensione più diluita.,

Ricorda se una cella si sovrappone a una regola, contala come ” in “se si sovrappone alla regola superiore o destra e” out ” se si sovrappone alla regola inferiore o sinistra (Figura 3G).

L’area del centro (Figura 3B) e ogni quadrato d’angolo (Figura 3C-F) è 1 mm x 1 mm = 1 mm2: la profondità di ogni quadrato è 0,1 mm. Il volume finale di ogni quadrato a quella profondità è 100nl.,

una Volta ottenuto il totale conteggio delle cellule, la concentrazione cellulare può essere calcolato con la seguente formula:

Così, per esempio, se hai diluito il vostro campione 1:1 con Trypan blu, e avete contato 325 cellule in 4 piazze angolo più centrale piazza grande, totale di cellule per ml =

Se si desidera conoscere il numero di celle nel campione originale, basta moltiplicare la concentrazione di cellule totali e il volume del campione. Ad esempio, se il volume del campione originale è di 5 ml, il campione ha un totale =