Abstract

La DNA ligasi di E. coli è un polipeptide di peso molecolare 75.000. L’enzima indotto da T4 comparabile è leggermente più piccolo (da 63.000 a 68.000). Entrambi gli enzimi catalizzano la sintesi dei legami fosfodiesterici tra i gruppi adiacenti 5 ‘- fosforile e 3 ‘ – idrossile nel DNA duplex intaccato, accoppiato alla scissione del legame pirofosfato di DPN (E. coli) o ATP (T4)., La sintesi del legame fosfodiestere catalizzata da entrambi gli enzimi avviene in una serie di questi passaggi discreti e comporta la partecipazione di due intermedi covalenti (Fig. 1). Un’analisi cinetica allo stato stazionario della ligasi di E. coli catalizzata dalla reazione supporta questo meccanismo e dimostra ulteriormente che l’enzima-adenilato e il DNA-adenilato sono intermedi cineticamente significativi sul percorso diretto della sintesi del legame fosfodiestere.

Un ceppo di E. coli con una mutazione nel gene strutturale per la DNA ligasi che si traduce nella sintesi di un enzima anormalmente termolabile è invabile a 42°C., Sebbene in grado di crescere a 30°C, il mutante è ancora difettoso a questa temperatura nella sua capacità di riparare i danni al suo DNA causati dall’irradiazione ultravioletta e dagli agenti alchilanti. A 42°C, tutto il DNA appena replicato è sotto forma di brevi 10S “frammenti di Okazaki”, un’indicazione che la ragione per la mancata sopravvivenza del mutante in queste condizioni è la sua incapacità di sostenere la fase di legatura che è essenziale per la sintesi discontinua del cromosoma di E. coli. La DNA ligasi è quindi un enzima essenziale richiesto per la normale replicazione e riparazione del DNA in E. coli., Le ligasi purificate del DNA si sono dimostrate reagenti utili nella costruzione in vitro di molecole di DNA ricombinante.