微生物学、細胞培養、血液作業および細胞を使用する他の多くの生物学的応用には、実験のために細胞濃度を決定する必要があります。

細胞計数はかなり簡単であり、血球計数を行うために19世紀のフランスの解剖学者Louis-Charles Malassezによって発明されたデバイスであるhemocytometerと呼ばれる計数室 血球計は、中央にエッチングされた垂直線のグリッドを持つ厚いガラス顕微鏡スライドで構成されています。, グリッドには、線で覆われた領域がわかるように寸法が指定されているため、特定の溶液体積のセル数を数えることができます。

図1. 古典的な血球計

最も一般的なタイプの血球計は、二つの別々の鏡のような研磨されたグリッド表面を囲み、カバースリップ実装領域を提供する中央に”H”,

血球計のセット

開始する前に、レンズペーパーでほこりを取り除き、血球計とそのカバースリップの両方がきれいであることを確認してください。 血球計に取り付けるために使用されるカバースリップは、液体の滴の表面張力を克服することができなければならないため、従来の顕微鏡カバースリップよりも厚くなるように特別に作られています。

細胞の懸濁液に荷を積む前にカバースリップをカウントの表面上最初に置くことを確かめて下さい。, 次に、図2のように、サンプルと一緒にピペットチップをV字型のウェルのいずれかに置き、サンプルを静かに排出します。 Coverslipの下の区域は毛管行為によって満たす。 十分な液体は映された表面がちょうど覆われるように、通常10µlのまわりで導入されるべきですが、表面を満たし過ぎないで下さい。 あなたは一つの血球計に二つのサンプルをロードすることができます,二つのグリッドのそ

図2., 血球計に負荷する

負荷された血球計を顕微鏡ステージ上に配置し、計数グリッドを低電力で焦点にする。 気泡を導入し、カウントを困難にするかもしれないのでサンプルが幾つかの分の間解決し、coverslipを動かすことを避けるようにして下さい。

血球計の細胞を数える

血球計の完全なグリッドには、それぞれ1mm2である九つの正方形が含まれています（図3）。 血球計数計の中央計数面積（図3B）には25の大きな正方形が含まれており、それぞれの大きな正方形には16の小さな正方形があります。, カウントするときは、セルを二度カウントしないように、大きな正方形の両側の線上のセルのみをカウントします（図3G）。 懸濁液は、細胞または他の粒子が格子上で互いに重ならないように十分に希釈されるべきであり、均一に分布されるべきである。

図3. 血球計で細胞を数える。

死んだ細胞と生きた細胞を区別するために、試料はしばしばトリパンブルーなどの特定の染色で希釈される。, この染色法は、色素排除染色とも呼ばれ、死んだ細胞の細胞膜を選択的に貫通して青色に着色するジアゾ色素を使用するが、生きた細胞の膜に吸収されず、生きた細胞を染色から除外する。 顕微鏡下で見ると、死んだ細胞は濃い青色で表示されます（図4）

図4。 血球計上の生細胞のトリパンブルー排除。 （矢印は死んだ細胞の膜を横切って色素の取り込みを示します。,)

カウントを実行するには、目的のセルタイプを認識するために必要な倍率を決定し、選択された正方形のセルを体系的にカウントして、総カウントが約100セル、統計的に有意なカウントに必要なセルの最小数になるようにします。

大きなセルの場合、四つの大きな角の正方形（図3C-F）と中央の正方形（図3B）の内側のセルを数えるだけです。 小さな細胞の密な懸濁液のためには、中央の正方形（図3B）の四つの外側と中央の正方形の細胞を数えるか、より希薄な懸濁液を作ることができます。,

セルがルールと重なっている場合は、上または右のルールと重なっている場合は”in”、下または左のルールと重なっている場合は”out”としてカウントします（図3G）。

中央（図3B）と各コーナー正方形（図3C-F）の面積は1mm x1mm=1mm2であり、各正方形の深さは0.1mmであり、その深さにおける各正方形の最終容積は100nlである。,

総細胞数を取得したら、細胞濃度は次の式から計算できます。

たとえば、サンプル1:1をトリパンブルーで希釈し、325個の4角の正方形に中央の大きな正方形を加えた場合、mlあたりの総細胞数=

元のサンプルに含まれている細胞の数を知りたい場合は、細胞濃度にサンプル量の合計を掛けるだけです。 たとえば、元のサンプル容量が5mlの場合、サンプルの合計=

になります