正確なゲノム複製は、任意の生物の生存にとって重要です。 DNAコピーの一般的な概念は、DNAの二重らせん構造の解明と塩基対の相補性の同定によって明らかであった(1):核酸塩基の一本鎖は、新しい鎖の合成のためのテンプレートとして機能することができます。 これらの発見の十年以内に、エージェントはDNA鎖の重複を触媒する大腸菌から精製されました（2）。 この薬剤は”ポリメラーゼ”と名付けられた。 E., 最初に発見されたdnaポリメラーゼであるcoli DNAポリメラーゼIは、主要な複製ポリメラーゼではなく、遅延鎖岡崎断片分解およびDNA修復に関与するものであった。 これは、多くのDNAポリメラーゼファミリーの将来の発見を予感させ、それぞれがDNA複製および修復のための特定の細胞要件を提供する。

DNAポリメラーゼは、本質的に重要であるのと同じ理由で、生命科学における基本的な酵素として役立ちます：DNAをコピーします。 ポリメラーゼの適用はDNAの分類、配列および拡大を含んでいる。, ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、特定のDNAセグメントを指数関数的に増幅するために好熱性ポリメラーゼを用いて広く使用されている技術であり（3）、世界中の生物学研究所でヒトおよび病原体診断から分子クローニングまで幅広いアプリケーションを可能にする。

ポリメラーゼ精度

PCRは、細胞が複製システムに置くのと同じ基本的な要求をポリメラーゼに 基本的に、ポリメラーゼは信頼性が高く、正確で高速でなければなりません。, ポリメラーゼの精度または”忠実度”は、鋳型鎖によって指定されるように正しいヌクレオチドを組み込む傾向を指す。 標準的なPCR酵素は、驚くことではないが、非常に正確である。 低忠実度PCRポリメラーゼと考えられているThermus aquaticus(Taq)DNAポリメラーゼでさえ、約ヌクレオチド挿入で一度だけ間違いを犯します(12)。, ポリメラーゼの発見とエンジニアリングの努力は、塩基置換ミスをほとんどしない高忠実度ポリメラーゼを生み出し、DNAシーケンシング法によって何百万もの合成された塩基を読み取り、ポリメラーゼによるエラーを検出する必要があります単一分子シーケンシングによる忠実度の測定の進歩は、Q5®高忠実度DNAポリメラー,

忠実度チェックポイント：活性部位およびそれ以降の幾何学的選択

DNAポリメラーゼは、ヌクレオチド取り込み部位およびそれ以降の一連の分子チェックポイントを用いて正確な複製を保証する（1）。 中の塩基の正しい着信の塩基位置づけのために生産的な配置の触媒グループ、効率化を追求めています。 触媒作用のためのこのアライメントは、誤ったワトソン-クリック塩基対によって引き起こされる位置の歪みに敏感であり、誤ったまたは非同族塩基対での速度論的失速を可能にする。,

DNAポリメラーゼの校正

忠実度を高める別の方法は、ポリメラーゼが3→5エキソヌクレアーゼ活性を有することであり、”校正”と呼ばれる。 Taq DNAポリメラーゼは、上記の塩基対と活性部位の分子チェックポイントを使用すると、信じられないほど正確ですが、校正酵素はさらに高い忠実度を持つことができます。 この追加の精度は校正によって伝えられ、ポリメラーゼは正しいヌクレオチドがテンプレートに挿入されているかどうかを”チェック”します。, ミスマッチが検出された場合、DNAは重合ドメインからポリメラーゼのN末端3→5エキソヌクレアーゼドメインに移される。 誤って取り込まれたヌクレオチドは切除され、DNAは重合ドメインに戻り、コピーを再開することができます（図2）。

バクテリオファージT4は、正確なDNA複製のための3→5エキソヌクレアーゼ活性の重要性を評価するための有用な実験システムであることが判明した（6）。 （DNAポリメラーゼをコードする）T4遺伝子43の突然変異は、忠実度の減少または増加のいずれかであることが同定された。 変異酵素に対するエキソヌクレアーゼ／ポリメラーゼ（Ｎ／Ｐ）活性比を定義することにより，低いＮ／Ｐ比のポリメラーゼは高いＮ／Ｐ比のポリメラーゼよりもエラーが発生しやすいことが分かった。, この観察の説明は、不一致の塩基を取り込むと、ポリメラーゼ活性がより高いN/P比を有する酵素においてそれを拡張する前に、エキソヌクレアーゼがヌクレオチドを除去する可能性がより高いということである。 興味深いことに、ポリメラーゼの校正の有効性は、配列依存性を示すことができます。 例えば、ＡＴリッチ配列は、ＧＣ領域よりも効果的に校正される。 この不一致は、ストランド溶融を容易にするＡＴ領域の安定性が低く、したがって校正活性が低いためであると考えられる。,

3→5エキソヌクレアーゼ活性の欠如は、PCRにおける忠実度以外の影響を有する可能性がある。 Taq DNAポリメラーゼにおける校正活性の欠如は、この酵素（7）で可能なアンプリコンサイズを制限することが提案されている。 一般に、TaqはDNA断片を増幅するときに最適です<2kb、3-4kbまでの断片を処理できます。 このアンプリコンサイズに保たれると、Taqは堅牢で容易に最適化された酵素である。 しかし、-3kbを超えるとすぐに有効性が低下します。, PCRの間に、Taqはヌクレオチドをmisincorporateし、失速する傾向があり、正しく基の対になった3つの端と比較して伸びる前に分離するために本当らしいmismatchsを作り出します。 したがって、特定のアンプリコンサイズおよびポリメラーゼ誤り率では、十分な不一致3末端がPCRプロセスを効果的に阻害するために蓄積することが これらのミスマッチ3末端は、Taqを除去するための3→5エキソヌクレアーゼ活性を欠いているため、Taqにとって特に問題となる。, Deep Vent®DNAポリメラーゼのような少量の校正酵素を添加することにより、20kb以上の断片の増幅を達成することができる（図3）。 ブレンド中の酵素の大半はTaq DNAポリメラーゼであるため、おそらくプライマー拡張の大部分を行っており、校正ディープベントポリメラーゼはTaqによって生成される3つのミスマッチを除去する。,

ポリメラーゼ処理性

PCRに対する校正活性の重要性は、ほぼ二十年にわたって広く知られているが、別のプロパティ、処理性は、注目を集めています。, “処理性”は、単一の結合事象において（解離前に）ポリメラーゼによって取り込まれるヌクレオチドの数を指す用語である。 Taq DNAポリメラーゼは、結合イベントあたり約50ヌクレオチドを追加します(8)。 なぜこれが重要なのですか？ 低プロセッシビリティまたは”分布”ポリメラーゼは、プロセッシブポリメラーゼとは著しく異なる方法でテンプレートの集団を拡張します。 高度に分布するポリメラーゼは、テンプレートに結合し、ヌクレオチドのカップルを追加し、解離し、時間と均等に拡張することができるテンプレートの集団を残す。, 高processiveポリメラーゼ結合するテンプレート伸長結合イベント。

十分な時間を与えられた場合、プロセッシブまたは分配ポリメラーゼ反応の結果は、コピーされたテンプレートの集団になるということに従うでしょう。 しかしながら、特定の状況では、プロセッシブポリメラーゼが優れた性能を有する可能性がある。 大腸菌ポリメラーゼIII αサブユニット、メイン複製ポリメラーゼの一部は、<10塩基対の行列と<20ヌクレオチド/秒（nt/s）の速度を有する。, しかし、サブユニットが他のレプリソームサブユニット、特にスライディングクランプと関連付けると、有効な処理性と複製速度は、それぞれ>50kbと1,000nt/sに増加する（9）。 ポリメラーゼサブユニットがレプリソームで交換できることを示すデータがあるが、レプリソームは高速でプロセッシブなDNA複製を維持するため、”有効な処理性”という用語が使用される(10)。

PCRにおける処理性を利用するために、研究者は、古細菌ポリメラーゼ（にDNA結合ドメインを融合している11）。, このキメラ酵素はいくつかの改善された特性を有するが、特に、より短い延長時間でDNAを増幅し、より長いDNA産物をより効率的に産生することができ、 この融合アイデアは、NEBから入手可能なQ5High-Fidelity DNA PolymeraseとPhusion®High-Fidelity DNA Polymeraseの基礎となっています（図4）。

今後の方向性

多くのプロパティは、PCRポリメラーゼの有効性と有用性に影響を与えます。 ポリメラーゼ活性部位のアーキテクチャと校正活性は、最終製品の精度に影響を与えます。 DNA結合蛋白質へのポリメラーゼのブレンドそして融合はampliconの長さおよび、キメラの場合には、反作用の速度のための優秀なPCRの性能を与える。, 反応特異性を高めるためのホットスタートポリメラーゼ、マルチプレックスPCR（図5）、qPCRなどのPCRの他の重要な進歩も、生命科学に革命をもたらしました。

設計されたブレンドおよびキメラによって示されるように、ポリメラーゼ自体の特性は、PCR性能を改善するために調節することができる。 将来的には、ポリメラーゼの特性はますます特定のPCRアプリケーションに合わせて調整される可能性があり、そのように、これはNEBの研究の重要な分野で,

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