차세대 시퀀싱

소개

시퀀싱 인간 게놈의 완성되었다,2003 년에 13 년 후의 국제 협력과 투자의 USD3billion. 인간 게놈 프로젝트에 사용된 생어 시퀀싱(이기는 하지만 크게 최적화되어),주의 방법 DNA 시퀀싱의 발명 이후에 1970 년대.

늘에 대한 수요가 시퀀싱은 기하급수적으로 증가하고,다량의 genomic DNA 필요를 신속하게 분석할 수 있게,그리고 정확하게 입니다., 감사는 새로운 시퀀싱 기술을 통칭하여 차세대 시퀀싱을,그것은 시퀀스 전체 인간 게놈의 문제에 시간입니다.

생어 시퀀싱 및 차세대 시퀀싱

뒤에 원리는 다음세대 시퀀싱(NGS)의 생어 시퀀싱에 의존하는,모세관 전기 영동법입니다. 게놈 가닥은 단편화되고,각 단편의 염기는 단편이 템플릿 가닥에 대해 결찰 될 때 방출 된 신호에 의해 식별된다.,
생어 방법에 필요한 별도의 단계 시퀀싱,분리하여(전기)및 탐지기 어렵게 되었을 자동 샘플 준비 및 제한에 처리량 확장성과 해상도입니다. NGS 방법을 사용한 어레이 기반 시퀀싱을 결합하는 기술을 개발에서 생어 시퀀싱하는 프로세스의 수백만은 반응을 병렬에서 결과에서 아주 높은 속도로 처리량에 비용을 감소시켰다., 게놈 프로젝트 시퀀싱는 많은 년이 걸렸으로 생어 방법이 있습에서 완료되는 시간을 가진 NGS 지만,짧은 길이 읽기(의 수은 시퀀스에서 시간)와 적은 정확성을 가지고 있습니다.,

다음 세대의 방법 DNA 시퀀싱은 세 가지 일반적인 단계:

• 라이브러리 준비:라이브러리를 사용하여 만들어 임의의 조각화의 DNA,다음 내용 linkers
• 증폭:라이브러리를 사용하여 증폭 클론 증폭 방법 및 PCR
• 시퀀싱: DNA 시퀀스가 중 하나를 사용하여 여러 가지 다른 방법

라이브러리 준비

첫째,DNA 와 주로 중 하나 효소적 또는 초음파 처리(여기 초음파를 사용하여)을 만드는 작은 가닥이다., 접합기(합성 DNA 의 짧은,두 배 좌초된 조각)는 DNA 가닥을 결합하는 효소 인 DNA ligase 의 도움으로 이들 단편에 그 때 결찰된다. 접합기는 순서가 상보적인 대조물에 바운드되는 가능하게 합니다.

어댑터는 종합하도록 한 말은’끈끈한’동안 다른은’무뚝뚝한'(비 응집)으로 보기에 합류하는 무뚝뚝한 끝이 무뚝뚝한 끝난 DNA. 이것은 분자 사이의 염기 페어링 및 따라서 이량 체 형성의 잠재적 인 문제로 이어질 수 있습니다., 이를 방지하기 위해 3′-OH 와 5′-P 끝 사이에서 결찰이 일어나기 때문에 DNA 의 화학 구조가 활용됩니다. 을 제거하여 인산에서 끈적 끈적한 끝에 어댑터므로 생성 5′-OH 말 대신,DNA 리가할 수 없는 형태로 다리를 사이에 두 개의 테르(그림 1).,

기 위해서는 시퀀싱을 성공적인,라이브러리에 조각해야하는 공간적으로 클러스터에 PCR 식민지 또는’polonies’그들은 전통적으로 알려져 있으로 구성되어 많은 사본의 특정 라이브러리의 조각이 있습니다. 이러한 폴로니는 평면 방식으로 부착되기 때문에 어레이의 기능을 효소 적으로 병렬로 조작 할 수 있습니다. 이 도서관 건설 방법은 식민지 채집 및 E 의 이전 노동 집약적 절차보다 훨씬 빠릅니다., Sanger 시퀀싱을 위해 DNA 를 분리하고 증폭하는 데 사용되는 coli 클로닝은 단편의 읽기 길이를 희생합니다.

증폭

라이브러리 증폭은 필요하므로 수신된 신호에서 시퀀서 강한 충분히 검출될 정확하게됩니다. 효소 증폭을 통해’바이어 싱’및’중복’과 같은 현상이 발생하여 특정 라이브러리 단편의 우선 증폭을 유도 할 수 있습니다. 대신 PCR 을 사용하여 많은 수의 DNA 클러스터를 만드는 몇 가지 유형의 증폭 프로세스가 있습니다.,

에멀젼 PCR

에멀젼 오일,구슬,PCR 혼합 라이브러리 DNA 혼합 에멀젼을 형성에 이르는 대형 마이크로 웰니다(그림 2).

기 위해서 시퀀스 프로세스가 성공하려면 각 마이크로 잘 포함해야 하나 구슬을 가진 하나의 가닥 DNA(약 15%의 마이크로 우물가의 이 구성). 그런 다음 PCR 은 두 개의 개별 스트랜드를 선도하는 라이브러리 조각을 나타내며,그 중 하나(역 스트랜드)는 비드에 연결됩니다., 어닐링 된 DNA 는 프라이머 부위쪽으로 비드에서 시작하는 중합 효소에 의해 증폭된다. 그런 다음 원래의 역 스트랜드는 변성되고 비드로만 방출되어 비드로 다시 어닐링되어 두 개의 개별 스트랜드를 제공합니다. 이들은 둘 다 비드에 부착 된 두 개의 DNA 가닥을 제공하기 위해 증폭됩니다. 이 과정은 다음 DNA 의 클러스터로 이어지는 30-60 사이클에 걸쳐 반복된다. 이 기법에 대한 비판은 그 시간이 걸리는 성격 때문에,그것은 여러 단계를 수행해야 합니다(성형 및 파괴 에멀젼,PCR 증폭,농축 등등)에도 불구하고 그것의 광대한 사용에서의 많은 NGS 플랫폼입니다., 그것은 또한 상대적으로 비효율적이기 때문에 주위에 두 분의 에멀젼 마이크로 반응은 실제로 중 하나를 포함한 구슬입니다. 따라서 더 많은 잠재적 인 부정확성으로 이어지는 빈 시스템을 분리하기위한 추가 단계가 필요합니다.

브리지 PCR

의 표면 흐름 세포는 인구 밀도가 입히는 프라이머와 상호 보완적이하의 프라이머를 첨부하여서 DNA 라이브러리 조각합니다(그림 3). DNA 는 그 때 중합효소 근거한 연장을 위한 시약에 드러내는 무작위로 세포의 표면에 붙어 있습니다., 에 대한의 뉴클레오티드 및 효소의 자유로운 끝은 단 하나의 가닥 DNA 자신을 첨부하여 세포의 표면을 통한 보완적인 프라이머를 만들어,브리지 구조물입니다. 효소들과 상호 작용할 수 있도록 교량을 두 배 좌초하는 경우 있도록 변성가 발생합,두 단일 가닥 DNA fragments 에 부착된 표면에서 가깝습니다. 이 과정의 반복은 국소화 된 동일한 가닥의 클론 성 클러스터로 이어진다. 클러스터 밀도를 최적화하기 위해 시약의 농도를 매우 면밀히 모니터링하여 과밀을 방지해야합니다.,

시퀀싱

여러 경쟁법의 차세대 시퀀싱을 개발하여 다른 회사입니다.

454Pyrosequencing

Pyrosequencing 에 기반’시퀀싱 합성에 의해’는 경우에는 원칙적으로 보완적인 가닥 합성에서 효소의 존재는 효소(Figure4). 에 대비하여 dideoxynucleotides 을 종료 체인 증폭(에서 생어 시퀀싱),pyrosequencing 대신에 감지하 릴리스의 피로인산 경우 뉴클레오티드에 추가되 DNA chain., 그것은 처음에 에멀젼 PCR 기술을 사용하여 시퀀싱에 필요한 폴로니를 구성하고 상보적인 스트랜드를 제거합니다. 다음으로,ssDNA 시퀀싱 프라이머 hybridizes 의 끝에 스트랜드(프라이머를 바인딩 지역),다음은 네 개의 서로 다른 dNTPs 는 다음 순차적으로 만들어 밖으로 흐르는 우물의 지 polonies. 올바른 dNTP 가 효소 적으로 스트랜드에 통합되면 피로 인산의 방출을 유발합니다. ATP sulfurylase 와 아데노신의 존재 하에서,피로 인산염은 ATP 로 전환된다., 이 ATP 분자는 카메라로 감지 할 수있는 빛을 생성하는 루시페린의 옥실 루시 페린으로의 루시퍼 라제 촉매 변환에 사용됩니다. 상대적인 빛의 강도에 비례하는 양을 기준 추가(즉,피크 두 번의 강도를 나타내는 두 개의 동일한 기초에 추가되었습니다 succession).,

Pyrosequencing,에 의해 개발되 454 생명 과학의 하나 초기에 성공의 차세대 시퀀싱,실로 454 생명 과학 생성 된 첫 번째 상업적으로 사용할 수 있는 차세대 시퀀서입니다. 그러나이 방법은 다른 기술에 의해 가려졌으며 2013 년에 새로운 소유자 인 Roche 는 454 생명 과학의 폐쇄와 454pyrosequencing 플랫폼의 중단을 발표했습니다.,

토렌트 이온 반도체 시퀀싱

이온 토렌트 시퀀스를 사용하”시퀀싱 합성에 의해”접근 방식에서는 새로운 DNA,상호 보완적인 대상의 스트랜드가 합성된 하나의 기본다. 반도체 칩은 DNA 중합 중에 생성 된 수소 이온을 검출합니다(그림 5).

에멀젼 PCR 을 이용한 폴로니 형성에 이어,dna 라이브러리 단편은 pyrosequencing 에서와 같이 각 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트(dNTP)로 순차적으로 침수된다. DNTP 는 표적 물가에 뉴클레오타이드에 상보적인 경우에 새로운 물가로 그 때 통합됩니다., 뉴클레오타이드가 성공적으로 첨가 될 때마다 수소 이온이 방출되고 시퀀서의 pH 센서에 의해 감지됩니다. Pyrosequencing 방법에서와 같이,동일한 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 첨가되면,ph/신호 강도의 변화는 상응하게 더 크다.

이온 토렌트 시퀀스가 첫번째 상업적인 기술을 사용하지 않는 형광 및 스캔 카메라;그러므로 빠르고 저렴하게 높은 수준의 서비스 이외의 많은 다른 방법이 있습니다., 불행히도 연속적으로 추가 된 동일한 염기의 수를 열거하는 것은 어려울 수 있습니다. 예를 들어,길이 9 의 homorepeat 에 대한 ph 변화를 길이 10 중 하나로 차별화하는 것이 어려울 수 있으므로 반복적 인 시퀀스를 디코딩하기가 어렵습니다.

시퀀싱에 의해 결찰(솔리드)

솔리드는 효소의 방법 시퀀싱을 사용하는 DNA 리가,효소에서 널리 사용되는 생명 공학 기 ligate DNA 의 가닥(그림 6)., 에멀젼 PCR 은 비드 상에 표적 서열(즉,서열화 될 서열)에 접합 된 ssDNA 프라이머-결합 영역(어댑터로 알려짐)을 고정화/증폭하는 데 사용된다. 이 구슬은 다음에 입금 유리 표면을 고밀도의 구슬을 달성될 수 있는 증가에 기여 처리량 기술입니다.

한 번 구슬착가 발생한,프라이머 길이의 복합화가 어댑터,다음 구슬은 노출 라이브러리의 8-mer 프로브는 다른 형광성 염료에는 5’end 수도에서 3’end., 염기 1 및 2 는 염기 3-5 가 변성되고 염기 6-8 이 이노신 염기 인 동안 염기 서열화 될 뉴클레오타이드에 상보 적이다. 상보적인 프로브 만이 프라이머에 인접한 표적 서열에 하이브리드 화 될 것이다. DNA ligase 는 그 때 뇌관에 8mer 조사를 결합하기 위하여 이용됩니다. 염기 5 와 6 사이의 포스 포로 티오 에이트 결합은 형광 염료를은 이온을 사용하여 단편으로부터 절단 할 수있게한다., 이 협곡 수 있습 형광 측정할 수 있(네 개의 서로 다른 형광 염료는 사용할 사용자 인터페이스의 서로 다른 배출량 스펙트럼)과도 생성 5′-인산염 그룹을 받을 수 있는한 결찰. 시퀀싱의 첫 번째 라운드가 완료되면 확장 생성물을 녹인 다음 시퀀싱의 두 번째 라운드를 길이 N−1 의 프라이머로 완성합니다. 의 많은 라운드 시퀀싱을 사용하여 짧은 프라이머 각 시간(즉,N−2,N−3 등)를 측정하고 형광을 보는 대상은 데서 시작합니다.,

으로 인해 두 개의 기본 시퀀싱 방법은(이후 각 기지가 효과적으로 시퀀싱 두 번),솔리드 기술은 높은 정확도(에 99.999%여섯 번째 프라이머,그것은 가장 정확하의 두 번째 세대 플랫폼)도 저렴합니다. 7 일 만에 단일 실행을 완료 할 수 있으며 그 시간에 30gb 의 데이터를 생성 할 수 있습니다. 불행히도 주요 단점은 읽기 길이가 짧아서 많은 응용 분야에 적합하지 않다는 것입니다.,

뒤집을 수 있는 터미네이터 시퀀싱(Illumina)

뒤집을 수 있는 터미네이터 시퀀스에서 다른 전통적인 생어 방법에는 종료하는 대신 프라이머 확장 돌이킬 수 없을 사용하여 dideoxynucleotide,수정된 뉴클레오티드에서 사용 가역적이 종료됩니다. 는 동안 많은 다른 기술을 사용하여 에멀젼 PCR 증폭 DNA 라이브러리 조각은,가역 종료를 사용하여 브리지 PCR 의 효율성이 개선의 이 단계는 프로세스.,

뒤집을 수 있는 터미네이터로 그룹화할 수 있습니다:두 카테고리 3′-O-막 뒤집을 수 있는 터미네이터 및 3′-해 뒤집을 수 있는 터미네이터.

3′-O-단 가역 종

메커니즘을 사용한 시퀀싱에 의해 합성 접근 방식을 길게 프라이머를 단계적으. 첫째,시퀀싱 프라이머와 템플릿은 견고한 지지대에 고정됩니다. 원에 노출되는 각각의 네 개의 DNA 기초는 다른 fluorophore 연결(하는 질소 기초)외에 3′-O-azidomethyl 그룹(그림 7).,

만 정확한 기초 anneals 대상이고 그 후 출혈의 프라이머입니다. 단단한 지원은 다음 몇 군데리고 뉴클레오티드가 통합되지 않은 씻어와 형광 브랜 쪼개진을 사용하여 TCEP(tris(2-carboxyethyl)포스핀). TCEP 는 또한 3′-O-아지도 메틸 그룹을 제거하여 3′-OH 를 재생하며주기를 반복 할 수 있습니다(그림 8).,

3′-해 뒤집을 수 있는 터미네이터

가역 종료 그룹의 3′-해 뒤집을 수 있는 터미네이터 연결을 모두 베이스와 형광하는 그룹이 지금 행동의 일환으로 종료 그룹에 뿐 아니라 기자. 이 방법은 다르에서 3′-O-막 뒤집을 수 있는 터미네이터 방법은 세 가지 방법으로 첫째,3′-위치가 차단되지 않을(즉, 기초가 무료로 3′-OH);the fluorophore 은 모두 동일한 네 개의 염;그리고 각각의 수정된 기준은 흘러가 순차적으로 오히려 이상에서 동일한 시간입니다.

의 주요 단점은 이러한 기술은 그들의 가난한 읽는 길이 발생할 수 있습 중 하나에 의해 두 개의 현상입니다. 을 방지하기 위해서는 정관의 두 개의 뉴클레오티드에서 하나의 단계,블록에 위치,그러나 이벤트의 블록으로는 가난한 합성,물가 될 수 있는 위상을 만드는 노이즈 제한 읽는 길이입니다. 플루오로 포어가 부착되지 않거나 제거되지 않으면 노이즈가 생성 될 수도 있습니다., 이러한 문제는 다른 시퀀싱 방법에서 널리 퍼져 있으며 읽기 길이의 주요 제한 요소입니다.

이 기술은 HiSeq 및 MiSeq 플랫폼으로 Illumina 에 의해 개척되었습니다. HiSeq 는 백만 기지 당 0.02 달러의 비용으로 2 세대 시퀀서 중 가장 저렴합니다. 또한 완료하는 데 약 8 일이 걸리는 실행 당 600gb 의 높은 데이터 출력을 제공합니다.

세 번째 차세대 시퀀싱

새로운 집단의 기술 이후 사용하여 개발 하나의 분자 시퀀싱 및 단 하나 실시간 시퀀싱을 제거하고,필요한 클론 확대., 이 감소로 인해 발생하는 오류를 PCR,라이브러리를 단순화 준비하고,가장 중요한 것은 훨씬 더 높은 읽어 길이를 사용하여 높은 처리량 플랫폼입니다. 예 태평양 Biosciences’플랫폼을 사용하는 SMRT(분자 단 실시간)에 시퀀싱하게 읽고 길이의 주위에 하나는 천지와 Helicos 학을 이용하는 하나의 분자 시퀀싱 따라서 필요로하지 않는 증폭하기 전에 시퀀싱. Oxford Nanopore Technologies 는 현재 DNA 가 기공을 통과함에 따라 변화하는 전류를받는 실리콘 기반 나노 기공을 개발하고 있습니다., 이것은 예상되는 높은 처리량 빠른 방법의 DNA sequencing,지만 같은 문제 둔화되고 수송을 통해 공 먼저 해야 해결됩니다.

시퀀싱 epigenetic 수정

단으로 차세대 시퀀싱을 사용 genomic sequencing 엄청난 규모로,그것은 분명 최근에는 유전자 코드가 포함되지 않는 데 필요한 모든 정보에 의해 유기체. DNA 염기,특히 5-메틸 시토신에 대한 후성 유전 학적 변형은 또한 중요한 정보를 전달합니다.,

2 세대 시퀀싱 플랫폼은 모두 SANGER 시퀀싱과 같이 PCR 에 의존하므로 변형 된 DNA 염기를 서열화 할 수 없습니다. 사실,모두 5-methylcytosine5-hydroxymethylcytosine 으로 처리됩니다 시에 의해에 관여하는 효소 PCR;따라서,성적인 정보가 손실되는 동안 시퀀싱.,

황산 시퀀싱

황산 시퀀싱을 이용에 차이의 반응 시과 5-methylcytosine 와 관련하여 황산:시이 deaminated 여 황산을 형성하 uracil(를 읽으로 T 때 시퀀싱),반면 5-methylcytosine 는 비반응성(예:읽으로 C). 는 경우에는 두 시퀀싱 실행은 완료,병렬로 하나 황산으로 처리고 한없이 사이의 차이점의 출력을 두 실행 표시 갠 cytosines 에서 원래의 순서에 있습니다., 이 기술을 사용할 수도 있습 dsDNA,이후 처리 후에 황산으로,가닥을 더 이상 보완으로 처리할 수 있 ssDNA.

5-Hydroxymethylcytosine,또 다른 중요한 epigenetic 수정,반응과 황산하는 형태로 시-5-methylsulfonate(를 읽으로 C 때 시퀀싱). 이 복잡한 문제는 다소는 황산 시퀀스로 사용할 수 없습니다 진정한 표시 등의 메 틸에 자체입니다.,

산화 황산 시퀀싱

산화 황산 시퀀싱을 추가하는 화학 산화 단계로 변환하는 5-hydroxymethylcytosine5-formylcytosine 를 사용하여 칼륨 perruthenate,KRuO4,하기 전에 황산 처리. 5-포르밀시토신은 디포밀화되고 탈아민화되어 바이설파이트 처리에 의해 우라실을 형성한다. 이제 시토신,5-메틸 시토신 및 5-하이드 록시 메틸 시토신을 구별하기 위해 세 가지 별도의 시퀀싱 실행이 필요합니다(그림 9 참조).,

응용 프로그램의 차세대 시퀀싱

차세대 시퀀싱을 활성화 연구를 수집하는 방대한 양의 genomic 시퀀싱 데이터입니다., 이 기술은 다양 등의 응용 프로그램의:진단하고 이해 복잡한 질병;전체 게놈 시퀀싱;analysis of epigenetic 수정;미토콘드리아 시퀀싱;transcriptome 시퀀싱−는 방법을 이해 변경된 식의 유전자 변형에 영향을 주는 유기체;그리고 exome sequencing−에 돌연변이 exome 은 포함하는 것으로 생각된 90%를 돌연변이는 인간 게놈의 지도하는 질병이다., DNA 기법을 사용되었을 식별 및 분리하는 유전자에 대한 책임,특정 질병을 제공하의 정확한 복사본을 결함이 있는 유전자로 알려진’유전자 치료제’.

크게 초점이 맞춰지역에서는 유전자 치료는 암 치료 중 하나는 잠재적인 방법을 소개하는 센스 RNA(특히 방지하의 합성에서 타겟 단백질)oncogene,트리거를 형성 종양 세포입니다. 또 다른 방법은 암세포를 선택적으로 죽이는 유전자를 도입하는’자살 유전자 치료법’으로 명명된다., 많은 유전자 코드를 위한 독성 단백질 및 효소는 알려진,그리고 소개에 이러한 유전자의로는 종양 세포는 결과 세포 사망이다. 이 방법의 어려움은 건강한 세포를 죽이는 것을 방지하기 위해 매우 정확한 전달 시스템을 보장하는 것입니다.
이러한 방법에 의해 가능하게 시퀀싱 분석하는 종양의 유전자,허용하는 의료 전문가의 거리에는 화학요법 및 기타 암 치료 효과적으로 자신의 환자에게’독특한 유전자 조성,혁명을 일으키고 진단 단계의 개인 의학이다.,

DNA 시퀀싱 비용이 내려감에 따라 더 널리 보급 될 것이며,이는 여러 가지 문제를 야기합니다. 시퀀싱은 엄청난 양의 데이터를 생성하며 데이터 처리 및 저장과 관련된 많은 계산상의 문제가 있습니다. DNA 가 서열화 될 때 개인의 DNA 소유권과 같은 윤리적 문제도 있습니다. DNA 시퀀싱 데이터가 저장되어야 합니다 안전하게 때문에 우려가 있는 보험 그룹,저당 브로커와 고용주들이 사용할 수 있습 데이터를 수정하는 보험에 따옴표나 사이 구별 후보자., 한 시퀀싱 데 도움이 될 수 있습지 여부를 알 수 있는 개인은 위험이 증가하는 특정 질병,지만 환자 정보를 알고 있는 경우 질병에 대한 치료는 또 다른 문제입니다 모두.

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