정확한 게놈 복제에 대한 중요한의 생존 능력이 어떤 생명체이다. 일반적인 개념을 복사하기 위한 DNA 분명에게 해명의 DNA 의 두 번 나선형 구조물 및 식별을 기초의 쌍을 보완(1):하나의 가닥 nucleobases 와 역할을 수있는 템플릿의 합성에 대한 새로운드도 있습니다. 이러한 발견의 10 년 이내에 DNA 가닥 중복(2)을 촉매하는 대장균으로부터 약제를 정제 하였다. 이 약제는”중합 효소”라고 불렸다. 이자형., 대장균의 DNA 중합효소 연 내가 첫 번째 DNA 중합효소 연 발견되지 않았는 기본 증식하는 효소,하지만 그 대신 하나에 관여하는 지체 가닥 오카자키 조각상과 DNA 복구합니다. 이것은 많은 DNA 중합 효소 계열의 미래 발견을 예증했으며,각각은 DNA 복제 및 수리에 대한 특정 세포 요구 사항을 제공합니다.

DNA 폴으로 봉사한 기본적인 효소 생명 과학에서 같은 이유로 이들은 중요한 자연 속에서:그들은 복사합니다. 중합 효소 응용에는 DNA 라벨링,시퀀싱 및 증폭이 포함됩니다., 특정 증폭 프로토콜,의 중합효소 연쇄 반응(PCR)는 널리 사용되는 기법을 사용 하 고온 폴을 기하 급수적으로 증폭 특정 DNA 의 세그먼트(3)고 있는 응용 프로그램의 범위에서 인간과 병원체 진단을 분자 클로닝에서 생물학 labs around the world.

중합효소 연 Accuracy

PCR 두고 동일한 기본적인 요구에 효소로는 세포에 복제 시스템입니다. 본질적으로 중합 효소는 신뢰성 있고 정확하며 신속해야합니다., 중합 효소 정확도 또는”충실도”는 템플릿 가닥에 의해 지정된대로 올바른 뉴클레오타이드를 통합하는 성향을 나타냅니다. 표준 PCR 효소는 놀랍지 않게 매우 정확합니다. 저 충실도 PCR 중합 효소로 간주되는 Thermus aquaticus(Taq)DNA 중합 효소조차도 대략 뉴클레오티드 삽입(12)에서 한 번만 실수를합니다., 효소 발견하고 엔지니어링 노력을 생산하 고성능 폴,이는 거의 기본 대체 실수를 필요로하는,DNA 시퀀싱 방법을 읽는 수백만의 합성 기지를 감지하는 어떠한 오류에 의하여 효소의 발전에서의 측정실성에 의해 하나의 분자 시퀀싱 확인 Q5®High-Fidelity DNA 중합효소 연 있으로 충실도 280X 큰 thanTaq DNA polymerase(12).,

질 검문소:기하학적인 선택에서 현재 사이트와 이상

DNA 폴키 정확한 복제의 시리즈를 사용하여 분자 검문소,사이트에서 뉴클레오티드의 법인과 이상(1). 중 뉴클레오티드 또한 올바른 들어오는 뉴클레오티드는 위치에 대한 생산적인 맞춤 촉매 그룹장 효율적인 법인 설립. 이 맞춤을 위한 촉매이에 민감한 왜곡에 위치해 잘못된 Watson-Crick 기본 페어링할 수 있는 운동 실속에서 잘못된 또는 non-동족 기초 쌍이다.,

교정 DNA 폴

의 또 다른 방법이 증가능성을 위한 효소의 3→5exonuclease 활동이라 불리는”교정”. 를 사용하는 기본 페어링과 active 사이트 분자 검사점을 설명한 위 Taq DNA 중합효소 연는 믿을 수 없을만큼 정확하지만,교정 효소를 가질 수 있는 심지어 더 높은 실현합니다. 이 추가적인 정확도는 전달을 통한 교정으로,효소”확인”는지 여부를 올바른 뉴클레오티드에 삽입합니다., 불일치가 감지되면 DNA 는 중합 도메인에서 중합 효소의 N 말단 3→5 엑소 뉴 클레아 제 도메인으로 옮겨집니다. 잘못 통합 된 뉴클레오타이드는 절제되고 DNA 는 중합 도메인으로 다시 이동하며 복사가 재개 될 수 있습니다(그림 2).

박테리오파지 T4 입증하는 유용한 실험 시스템에 대한 평가의 중요성 3→5exonuclease 활동에 대한 정확한 DNA 복제(6). T4 유전자 43(DNA 중합 효소를 암호화하는)의 돌연변이는 충실도를 감소 시키거나 증가시키는 것으로 확인되었다. 를 정의하여 exonuclease/효소(N/P)활동에 대한 비율 돌연변이 효소가 발견되었는 폴 저렴한 N/P 비율이었다 더 많은 오류가 발생하기 쉬운 그들 보다는 높은 N/P 비율., 에 대한 설명이 관찰한다는 것입니다에 따라 설립의 일치하지 않는 기준이 그것이 더 많은 가능성이 높 exonuclease 제거 뉴클레오티드 전에 효소 활동을 것이다:그것은에서는 효소를 가진 높은 N/P 비율. 흥미롭게도,중합 효소의 교정 효과는 서열 의존성을 보여줄 수 있습니다. 예를 들어,at-rich 시퀀스는 GC 영역보다 더 효과적으로 교정됩니다. 이러한 불일치는 스트랜드 용융 및 따라서 교정 활성을 용이하게하는 AT 영역의 안정성이 낮기 때문인 것으로 생각된다.,

3→5 엑소 뉴 클레아 제 활성의 부재는 PCR 에서 충실도 이외의 파급 효과를 가질 수있다. Taq DNA 중합 효소에서 교정 활성의 결여는이 효소로 가능한 amplicon 크기를 제한하기 위해 제안되었다(7). 일반적으로 Taq 는 DNA 단편<2kb 를 증폭 할 때 가장 잘 수행되며 최대 3~4kb 의 단편으로 작업 할 수 있습니다. 이 amplicon 크기로 유지하면 Taq 는 견고하고 쉽게 최적화 된 효소입니다. 그러나~3kb 이상에서는 효과가 빠르게 떨어집니다., 중 PCR,Taq 것입니다 misincorporate 뉴클레오티드와 생산하는 불일치하는 경향은 실속과 더 가능성이 해리를 확장하기 전에 비교하여 올바르게 기초 쌍 3 종료됩니다. 따라서,특정 amplicon 크기 및 중합효소 연 오류 평가 충분히 일치하지 않는 3 종료할 수 있습 축적 효과적으로 억제 PCR 과정입니다. 이러한 일치하지 않는 3 개의 말단은 이들을 제거하기위한 3→5 엑소 뉴 클레아 제 활성이 부족하기 때문에 Taq 에 특히 문제가된다., Deep Vent®DNA 중합 효소와 같은 소량의 교정 효소를 첨가함으로써 20kb 이상의 단편의 증폭을 달성 할 수 있습니다(그림 3). 이후 대부분의에서 효소의 혼합 Taq DNA 중합효소 연 그것은 아마도 대량의 프라이머를 확장,과 함께 교정 깊은 배출 효소 제거하는 억제 3 불일치에 의해 생성된 Taq.,

중합효소 연 Processivity

의 중요성을 교정하는 활동을 PCR 가 널리 알려져있는 거의 두 가지 수십 년 동안,하지만 다른 속성,processivity,의 증가 증가 관심을 얻고 있다., “Processivity”는 단일 결합 이벤트(해리 전)에서 중합 효소에 의해 혼입 된 뉴클레오타이드의 수를 나타내는 용어입니다. Taq DNA 중합 효소는 결합 이벤트 당 약 50 개의 뉴클레오타이드를 첨가한다(8). 왜 이것이 중요합니까? 낮은 processivity 또는”분배”polymerase 는 processive polymerase 보다 눈에 띄게 다른 방식으로 템플릿의 집단을 확장합니다. 매우 분배 효소 바인딩하여 템플릿을 추가,몇 가지의 뉴클레오티드와 dissociates 떠나는 인구의 템플릿을 확장할 수 있는 동등하게 시간을 가진., 매우 processive polymerase 는 템플릿을 결합하고 더 긴 결합 이벤트로 확장됩니다.

충분한 시간이 주어지면 processive 또는 distributive polymerase 반응의 결과가 복사 된 템플릿의 모집단이 될 것입니다. 그러나,특정 상황에서는 프로 세시 폴리 메라 이즈가 우수한 성능을 가질 가능성이 있습니다. 대장균 polymerase III α 소 단위,부분의 주요 증식하는 효소는 processivity 의<10 기초 쌍과 속도의<20 뉴클레오티드/second(nt/s)., 그러나,소 단위 동료들과 다른 replisome subunits,특히 미끄러 클램프,효과적인 processivity 및 복제 속도가 증가하는>50kb1,000nt/s,각각이 있습니다(9). 용어”효과적인 processivity”사용가 있기 때문에 데이터를 나타내는 효소 소 단위 교환할 수 있습에서 replisome 지만,replisome 유지 빠르고,processive DNA 복제(10).

PCR 에서 processivity 를 활용하기 위해 연구자들은 DNA 결합 도메인을 archaeal polymerase(11)에 융합 시켰습니다., 이 chimeric 효소는 여러 가지 향상 속성,하지만 특히 할 수 있을 증폭 DNA 으로 확장 짧은 시간과 생산 이상 DNA 제품을 더 효율적으로,따라서 전반적으로 단축 thermocycling 다. 이 융합 아이디어는 NEB 에서 사용할 수있는 두 가지 중합 효소 인 Q5 고 충실도 DNA 중합 효소와 Phusion®고 충실도 DNA 중합 효소의 기초입니다(그림 4).

향후 방향

많은 특성이 PCR 중합 효소의 효능 및 효능에 영향을 미친다. 중합 효소 활성 사이트 아키텍처 및 교정 활성은 최종 생성물의 정확성에 영향을 미친다. Dna 결합 단백질에 대한 중합 효소 블렌드 및 융합은 amplicon 길이 및 키메라의 경우 반응 속도에 대해 우수한 PCR 성능을 부여합니다., 다른 중요한 발전에 PCR 등 뜨거운 시작 폴 증가 반응성,multiplex PCR(그림 5)과 qPCR 도 혁명을 생명 과학.

에 의해 증명으로 설계된 혼합 및 키메라,속성의 중합효소 연 자체를 조절할 수 있을 개선하 PCR 성능입니다. 미래에 그것을 가능성이 있는 중합효소 연 속성이 점점에 맞게 특정 PCR 응용 프로그램,그리고 이와 같이,이것은 중요한 지역에서 연구의 NEB.,

보기 NEB 의 DNA 중합 효소 선택 차트