plantengroei

zaden van tomaat CM (Castlemart, wild type) werden gekiemd en gekweekt in een groeikamer Onder 18 uur licht bij 27 °C en 6 uur donker bij 18 °C in hydrocultuur of substraatcultuur. Planten met gezonde geëxpandeerde ware bladeren werden geoogst voor de bereiding van GCP ‘ s (aanvullend bestand 1: Fig. S1 en Fig. 1)., De epidermale fragmenten van echte bladeren werden verzameld zoals beschreven voor Methode L of methode S.

Guardcellen in verschillende stadia van enzymatische spijsvertering in methode L (a–c) en methode S (d–l). A-f zeven volledig geëxpandeerde bladeren van de hydrocultuur planten geselecteerd voor GCP isolatie (aanvullend bestand 1: Fig. S1). G-I zeven volledig geëxpandeerde bladeren van de substraatcultuur planten geselecteerd voor GCP isolatie., j-l vier volledig geëxpandeerde bladeren van de hydrocultuur planten (jongere planten in vergelijking met d–f) geselecteerd voor GCP isolatie. a, d, h, k de status van GCs na 1,5, 0,5, 2 en 0,5 uur spijsvertering in enzymoplossing 1. b, e de status van GCs na 2 en 1 uur spijsvertering in enzymoplossing 2. c, f, i, l de status van GCs na 3,5, 2,5, 4,5 en 1,5 uur spijsvertering in enzymoplossing 2. Schaalstaven geven 20 µm

bereiding van GCP ‘ s: methode L

De volledig geëxpandeerde echte bladeren (gewogen ~ 10 g) werden geoogst van hydroponische tomatenplanten., Vervolgens werden de bladeren gedurende 1 min (drie pulsen van 20 s) gemengd in een blender (18.000 rpm/min) in 250 ml koud gedestilleerd water. Het gemengde bladmengsel werd gegoten door een 74-µm nylon gaas om gebroken mesofylcellen te verwijderen en meerdere malen gespoeld met koud gedestilleerd water totdat het grootste deel van het schuim dat door het mengen werd geproduceerd grotendeels was verdwenen en de epidermale fragmenten bleekgroen waren. Vervolgens werden de epidermale weefsels overgebracht in een kolf met 50 ml enzymoplossing 1, die gedurende 1,5 uur bij 27 °C in het donker in een schudwaterbad werd geïncubeerd, waarbij de schudsnelheid op 100 rpm werd ingesteld., Na 1,5 uur incubatie werden epidermale fragmenten verzameld op een 58 µm nylon gaas, voorzichtig gespoeld met basic medium 2 en overgebracht in 50 ml enzymoplossing 2 in een kolf. Deze oplossing met de fragmenten werd vervolgens bij 25 °C in een schudwaterbad (70 rpm) geïncubeerd totdat de meeste GCP ’s werden vrijgegeven, meestal na ongeveer 3,5 uur. om de afgifte van GCP’ s uit de epidermale schillen te verbeteren, werd de kolf aan het einde van de spijsvertering een paar seconden zachtjes met de hand gezwenkt., Bovendien werden de schillen in de enzymoplossing enkele malen voorzichtig doorgegeven door een pipettor die was uitgerust met een punt van 5 ml dat werd gesneden om de GCP ‘ s vrij te geven. Het enzymolyse-effect werd onder een microscoop beoordeeld. Het tweede enzym-digestiemengsel werd gefilterd door 37-µm nylon gaas. De epidermale weefsels op het gaas werden gespoeld met basic medium 2 om GCP ‘ s verder vrij te geven. De enzymoplossing die de protoplasten bevat, werd vervolgens gefilterd door een nylon mesh van 15 µm en de vrijgekomen GCP ‘ s werden verzameld (in centrifugebuizen van 50 ml) door 6 minuten bij 300×g te centrifugeren., De GCP ’s werden drie keer gewassen met basic medium 2 om GCP’ s vrij te houden van de pellet van gemengde cellen en ander vuil. Na verwijdering van het supernatans werd een volume van 5 ml protoplasten verkregen, dat bij 4 °C in het donker werd bewaard voor de volgende zuivering of voor andere experimenten.

bereiding van GCP ‘ s: methode s

Dit protocol is afgeleid van “methode L”, met één modificatie waarbij de samenstelling van enzymoplossing 1 betrokken was. Enzymoplossing 1 bestaat uit 1,0% (g/v) cellulose “Onozuka” RS, 0,01% (g/v) Pectolyase Y-23, 0,1% (g/v) PVP-40, 0,25% (g/v) runderserumalbumine en 0.,5 mM L-ascorbinezuur, opgelost in basismedium 1. De verbetering van Methode S verkort de benodigde tijd met 2 uur in vergelijking met methode L. de eerste enzymvertering heeft slechts 0,5 uur nodig, terwijl de tweede enzymvertering 2,5 uur en 1,5 uur nodig heeft (bij jonge planten Fig. 1).

zuivering van GCP’s

om fragmenten van vaatweefsel en contaminanten uit GCP’ s te verwijderen, werd een extra zuiveringsstap uitgevoerd die de zuiverheid van de GCP ‘ s significant verbetert., Het zuiveringsprotocol van de GCP ‘ s was volgens die van eerdere methoden , met aanpassingen aangepast voor tomaat hier beschreven. Aan de GCP-suspensie werd basisoplossing 2 toegevoegd om een eindvolume van 8 ml te verkrijgen. Zes milliliter Histopaque (Nr. 1077, Sigma-Aldrich) werd zorgvuldig in de bodem van een centrifugebuis gepipetteerd. De GCP ‘ s werden vervolgens zorgvuldig bovenop de Histopaque gelaagd. De buizen werden gedurende 20 minuten gecentrifugeerd bij 150×g, waarna de GCP ‘ s werden verzameld uit de interface van de twee oplossingen met een pasteurpipet en overgebracht naar een nieuwe reageerbuis., De GCP ’s werden verdund met basisoplossing 2, waarna de buizen gedurende 6 minuten bij 300×g werden gecentrifugeerd. het supernatans werd verwijderd en de geïsoleerde GCP’ s werden geresuspendeerd in 1 ml basisoplossing 2 en in het donker op ijs bewaard tot de volgende tests.

beoordeling van de levensvatbaarheid van protoplast

de levensvatbaarheid van GCP ‘ s werd geëvalueerd door middel van fluorescentiemetingen met fluoresceïnediacetaat (FDA). De kleurstofhydrolyse werd waargenomen na het mengen van GCP ‘ s met het incubatiemengsel gedurende 5 minuten. De bedrijfsconcentratie van FDA was 0,01% (w/v) opgelost in aceton., Protoplast preparaten werden bekeken en afgebeeld met behulp van een Zeiss Axio Observer D1 fluorescentiemicroscoop met blauwe excitatie met behulp van de FITC-filtercombinatie.

bereiding van MCP ‘ s

De methode voor het isoleren van Solanum lycopersicum is gewijzigd van de methode die is beschreven door Romano et al. . Volledig geëxpandeerde bladeren worden in 0,5 cm2 stukken gesneden. De stukjes blad worden vervolgens overgebracht naar 30 ml enzymoplossing: 5 mM Mes, 0,65 M D-mannitol, 1 mM CaCl2, 0,5% (w: v) Macerozyme R-10 (Yakult, Japan), 1% (w: v) Cellulase R-10 (Yakult, Japan), 0,25% (w: v) BSA en 0,1% (w: v) PVP-40, pH 5,5 (KOH)., De spijsvertering wordt 2 uur lang bij 25 °C uitgevoerd met langzaam schudden (40 excursies per min) in een waterbad. De enzymoplossing wordt groen na zachte wervelende beweging, die de afgifte van protoplasten aangeeft. De spijsverteringstijd hangt af van de experimentele doelen en gebruikte materialen. Het is niet nodig om alle protoplasten van bladstukjes vrij te maken. De oplossing wordt gefilterd door 37 µm nylon gaas in een centrifugebuis van 50 ml. De overgebleven bladdelen worden gespoeld met 20 ml incubatiemedium (0,65 M D-mannitol, 1 mM CaCl2) en het filtraat wordt eveneens verzameld., De vrijgekomen MCP ‘ s werden verzameld door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 100×g. de pellet werd driemaal gewassen met 0,65 M D-mannitol met 1 mM CaCl2. Geïsoleerde MCP ‘ s werden opgeslagen op ijs in het donker tot gebruik.

semikwantitatieve reverse-transcriptie PCR-analyses

totaal RNA werd geëxtraheerd uit GCP ’s en mesophyll cell protoplasten (MCP’ s) met behulp van Arcturus PicoPure RNA-Isolatiekit (Applied Biosystems, Cat nr. 12204-01, USA) volgens het Protocol van de fabrikant. , Totaal RNA werd omgekeerd-getranscribeerd in cDNA gebruikend het super-Script eerste-streng synthese systeem (transgen Biotech) volgens de instructies van de fabrikant. Semi-kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd met twee genen die specifiek in wachtcellen of mesophyll cellen werden uitgedrukt om de protoplast zuiverheid te beoordelen. Het Actin gen (forward primer, 5′-cctctcagttcccgttgaatag-3′; reverse primer, 5′-TCACCAGTCCAACACAA TAC-3′) werd gebruikt als controle voor RT-PCR experimenten., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) analyses

de qRT-PCR werd uitgevoerd met vier genen die bij voorkeur werden uitgedrukt in guardcellen of werden afgebeeld als regulatoren van ABA-respons en transcript niveau inductie of onderdrukking vertoonden in reactie op MeJA in guard cellen. Gcps-suspensie geïncubeerd in 1,5 ml microfugebuisjes bij kamertemperatuur gedurende 10 min, en vervolgens behandeld met 50 µM ± MeJA (eindconcentratie) gedurende 5, 10, 15, 20 min. Na de incubatie werden de wachtcellen gelijktijdig verzameld, ingevroren en opgeslagen bij-80 °C tot verdere analyse., Aangezien protoplasten de expressie van stress-geassocieerde genen induceert, werden twee verschillende transcriptieremmers, actinomycine D (33 mg/L) en cordycepin (100 mg / L), gebruikt in alle isolatieprocedures, inclusief de eerste stap van het mengen . De qRT-PCR analyses van vroege wondrespons genen expressie met of zonder de transcriptie remmers werden uitgevoerd.

totaal RNA werd geïsoleerd uit de GCP’ s, met behulp van Arcturus PicoPure RNA-Isolatiekit (Applied Biosystems, Cat nr. 12204-01, USA) volgens het Protocol van de fabrikant. , Alle monsters van RNA werden verteerd met RNase-vrije DNase om genomic DNA te verwijderen. De kwaliteit en de concentratie van elk van de monsters van RNA werden bepaald gebruikend Namedrop 2000 spectrofotometer (Thermo Scientific). De integriteit van RNA werd ook gecontroleerd door agarose-gelelektroforese. Voor real-time PCR, werd totaal RNA omgekeerd-getranscribeerd in cDNA gebruikend het systeem van de super-Script eerste-streng synthese (transgen Biotech) volgens de instructies van de fabrikant., De cDNA werd gebruikt als een sjabloon om real-time PCR uit te voeren met Gen-specifieke primers (aanvullend bestand 1: tabel S1) en SYBR Green Mix (TaKaRa) in een CFX96 TouchTM Real-Time PCR detection system (Bio-Rad). Actin gen werd gebruikt als interne normalisatie in steekproeven. De vouwverandering in genuitdrukking werd berekend gebruikend ΔΔCt waarden.

eiwitextractie en SDS-pagina-analyses

oplosbare eiwitfracties van bladeren, MCP ’s en GCP’ s werden bereid volgens Li en Assmann . Alle volgende stappen werden uitgevoerd bij 4 °C., Protoplasten en bladeren poeder gemengd met 40 µl ijskoude buffer in microfugebuizen. De buffer was 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM MgCl2, 2 mM ethyleendiaminetetra−azijnzuur (EDTA), 0,25 mM ethyleenglycoltetra-azijnzuur (EGTA), 250 mM sucrose, 2 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en 10 µg ml-1 elk van de proteaseremmers leupeptine, pepstatine en aprotinine. Het homogenaat werd 20 minuten op ijs gehouden en vervolgens 15 minuten bij 10.000×g gecentrifugeerd en het supernatant werd gebruikt voor 10% SDS-pagina. De eiwitconcentraties werden gemeten door de Brandford Kits.