wzrost roślin

nasiona pomidora CM (Castlemart, Typ dziki) kiełkowano i hodowano w komorze wzrostu w ciągu 18 godzin światła w temperaturze 27 °C i 6 godzin ciemności w temperaturze 18 °C w hodowli hydroponicznej lub substratowej. Rośliny o zdrowych, rozszerzonych prawdziwych liściach zostały zebrane w celu przygotowania GCP (dodatkowy plik 1: rys. S1 i Rys. 1)., Fragmenty naskórka prawdziwych liści zostały zebrane zgodnie z opisem metody L lub metody S.

chroni komórki na różnych etapach trawienia enzymatycznego w metodzie L (a–c) i metodzie S (d–l). a-f siedem w pełni rozszerzonych liści roślin hydroponicznych wybranych do izolacji GCP (plik dodatkowy 1: rys. S1). g – i siedem w pełni rozszerzonych liści roślin substrat Kultury wybranych do izolacji GCP., j – L cztery w pełni rozwinięte liście roślin hydroponicznych (rośliny młodsze w porównaniu z d–f) wybrane do izolacji GCP. A, d, h, k Stan GCs po 1,5, 0,5, 2 i 0,5 h trawienia w roztworze enzymu 1. b, E stan GCs po 2 i 1 h trawienia w roztworze enzymu 2. c, f, i, l stan GCs po 3,5, 2,5, 4,5 i 1,5 h trawienia w roztworze enzymu 2. Listwy podziałki wskazują 20 µm

przygotowanie GCP: metoda L

w pełni rozwinięte prawdziwe liście (ważone ~ 10 g) zostały zebrane z hydroponicznych roślin pomidorów., Następnie liście mieszano przez 1 min (trzy impulsy po 20 s) w blenderze (18 000 obr./min) w 250 ml zimnej wody destylowanej. Mieszana mieszanka liści została wylana przez siatkę nylonową o średnicy 74 µm w celu usunięcia uszkodzonych komórek mezofilu i kilkakrotnie przepłukana zimną wodą destylowaną, aż większość piany wytwarzanej przez mieszanie w znacznym stopniu zniknęła, a fragmenty naskórka były bladozielone. Następnie tkanki naskórka przeniesiono do kolby zawierającej 50 ml roztworu enzymu 1, który inkubowano przez 1,5 godziny w temperaturze 27 °C w łaźni wodnej w ciemności, z prędkością wytrząsania ustawioną na 100 obr. / min., Po 1,5 h inkubacji fragmenty naskórka zebrano na siatce nylonowej o średnicy 58 µm, delikatnie przepłukano środkiem podstawowym 2 i przeniesiono do 50 ml roztworu enzymu 2 w kolbie. Ten roztwór zawierający fragmenty inkubowano w temperaturze 25 °C w łaźni wodnej (70 obr. / min) do czasu uwolnienia większości GCP, zazwyczaj po około 3,5 h. aby poprawić uwalnianie GCP z peelingów naskórkowych, kolbę delikatnie obracano ręcznie przez kilka sekund pod koniec trawienia., Ponadto peelingi w roztworze enzymu były delikatnie przepuszczane kilka razy przez pipetę wyposażoną w końcówkę o pojemności 5 ml, która została pocięta w celu uwolnienia GCP. Działanie enzymolizy oceniano pod mikroskopem. Druga mieszanina enzymu trawienia była filtrowana przez siatkę nylonową 37 µm. Tkanki naskórka na siateczce płukano Basic medium 2 w celu dalszego uwolnienia GCP. Roztwór enzymu zawierający protoplasty był następnie filtrowany przez siatkę nylonową 15 µm, a uwolnione GCP były zbierane (w 50-ml probówkach wirujących)przez wirowanie przez 6 minut w temperaturze 300 × g., GCP zostały umyte trzy razy z BASIC medium 2, aby utrzymać GCP wolne od granulatu mieszanych komórek i innych zanieczyszczeń. Po usunięciu supernatantu uzyskano objętość 5 ml protoplastów, która była przechowywana w temperaturze 4 °c w ciemności do następnego oczyszczenia lub do innych eksperymentów.

przygotowanie GCP: metoda S

protokół ten został zaczerpnięty z „metody L”, z jedną modyfikacją obejmującą skład roztworu enzymu 1. Roztwór enzymu 1 składa się z 1,0% (M/v) celulozy „Onozuka” RS, 0,01% (M/v) Pektoliazy Y-23, 0,1% (m/v) PVP-40, 0,25% (m/v) albuminy surowicy bydlęcej i 0.,5 mM kwas L-askorbinowy, rozpuszczony w podłożu zasadowym 1. Poprawa w metodzie S skróciła wymagany czas o 2 h w porównaniu z metodą L. pierwszy enzym trawienia potrzebuje tylko 0,5 h, podczas gdy drugi enzym trawienia potrzebuje 2,5 h i 1,5 h (u młodych roślin rys. 1).

Oczyszczanie GCP

aby usunąć fragmenty tkanki naczyniowej i zanieczyszczenia z GCP, przeprowadzono dodatkowy etap oczyszczania, który znacznie poprawia czystość GCP., Protokół oczyszczania GCP był zgodny z poprzednimi metodami, z modyfikacjami dostosowanymi do pomidorów opisanych tutaj. Roztwór podstawowy 2 dodano do zawiesiny GCP w celu uzyskania ostatecznej objętości 8 ml. Sześć mililitrów Histopaque (nr 1077, Sigma-Aldrich) zostało starannie wpompowanych w dno rurki wirówki. GCP zostały następnie starannie ułożone na szczycie Histopaque. Probówki zostały odwirowane przez 20 minut w temperaturze 150×g, po czym GCP zostały zebrane z interfejsu dwóch roztworów za pomocą pipety Pasteura i przeniesione do nowej probówki., GCP rozcieńczono roztworem zasadowym 2, a następnie odwirowano probówki przez 6 minut w temperaturze 300×g. supernatant usunięto, a wyizolowane GCP ponownie zawieszono w 1 ml roztworu zasadowego 2 i trzymano w lodzie w ciemności do kolejnych testów.

ocena żywotności protoplastów

żywotność GCP oceniano za pomocą pomiarów fluorescencyjnych z dioctanem fluoresceiny (FDA). Hydrolizę barwnika obserwowano po zmieszaniu GCP z mieszaniną inkubacyjną przez 5 minut. Stężenie operacyjne FDA wynosiło 0,01% (w/v) rozpuszczonego w acetonie., Preparaty protoplastu oglądano i obrazowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss Axio Observer D1 z wzbudzeniem niebieskim przy użyciu kombinacji filtrów FITC.

przygotowanie MCP

metoda izolowania Solanum lycopersicum jest zmodyfikowana z metody opisanej przez Romano et al. . W pełni rozwinięte liście są cięte na kawałki 0,5 cm2. Kawałki liści są następnie przenoszone do 30 ml roztworu enzymu: 5 mM Mes, 0,65 M D-mannitol, 1 mm CaCl2, 0,5% (w: v) Macerozymu R-10 (Yakult, Japonia), 1% (w: v) celulazy R-10 (Yakult, Japonia), 0,25% (w: v) BSA i 0,1% (w: V) PVP-40, pH 5,5 (KOH)., Trawienie przeprowadza się w temperaturze 25 °C przez 2 h z powolnym wstrząsaniem (40 wypadów na minutę) w łaźni wodnej. Roztwór enzymu zmienia kolor na zielony po delikatnym ruchu wirującym, co wskazuje na uwalnianie protoplastów. Czas trawienia zależy od celów eksperymentalnych i użytych materiałów. Nie jest konieczne uwalnianie wszystkich protoplastów z kawałków liści. Roztwór jest filtrowany przez siatkę nylonową 37 µm do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Zachowane fragmenty liści przepłukuje się 20 ml pożywki inkubacyjnej (0,65 m d-mannitolu, 1 mm CaCl2), a także zbiera się filtrat., Uwolnione MCP były zbierane przez wirowanie przez 5 minut w temperaturze 100×g. pellet był trzykrotnie przemywany 0,65 M d-mannitolem zawierającym 1 mm CaCl2. Izolowane MCP były przechowywane na lodzie w ciemności do czasu użycia.

Półilościowa analiza odwrotnej transkrypcji PCR

całkowity RNA został wyekstrahowany z GCP i protoplastów komórek mezofilowych (MCP) przy użyciu zestawu Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Nr kat. 12204-01, USA) zgodnie z protokołem producenta. , Całkowity RNA został przepisany do cDNA za pomocą Super-Script first-strand synthesis system (TransGen) zgodnie z instrukcjami producenta. Półilościowy RT-PCR przeprowadzono z dwoma genami, które zostały specjalnie wyrażone w komórkach guard lub komórkach mezofilowych w celu oceny czystości protoplastów. Gen aktyny (primer forward, 5′-CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′; Primer reverse, 5′-TCACCAGAGTCCCAACAA TAC-3′) był stosowany jako środek kontrolny do eksperymentów RT-PCR., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

ilościowe analizy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

qRT-PCR przeprowadzono z użyciem czterech genów, które preferencyjnie wyrażały się w komórkach ochronnych lub przedstawiały jako regulatory odpowiedzi ABA i wykazały indukcję lub represję poziomu transkrypcji w odpowiedzi na MeJA w komórkach ochronnych. Zawiesina GCP inkubowana w probówkach o pojemności 1,5 ml w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie poddawana obróbce 50 µM ± MeJA (stężenie końcowe) przez 5, 10, 15, 20 minut. Po inkubacji komórki strażnicze były zbierane jednocześnie, zamrażane i przechowywane w temperaturze − 80 °C do czasu dalszej analizy., Biorąc pod uwagę, że protoplasting indukuje ekspresję genów związanych ze stresem, dwa różne inhibitory transkrypcji, aktynomycyna D (33 mg/L) i kordycepina (100 mg/L), były stosowane we wszystkich procedurach izolacji, w tym w pierwszym etapie mieszania . Przeprowadzono analizę QRT-PCR ekspresji genów wczesnej odpowiedzi rany z inhibitorami transkrypcji lub bez nich.

całkowity RNA został wyizolowany z GCP przy użyciu zestawu Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Nr kat. 12204-01, USA) zgodnie z protokołem producenta., Wszystkie próbki RNA zostały strawione Dnazą wolną od RNazy w celu usunięcia genomowego DNA. Jakość i stężenie każdej z próbek RNA określono za pomocą spektrofotometru Namedrop 2000 (Thermo Scientific). Integralność RNA sprawdzano również za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. W przypadku real-time PCR całkowity RNA został przepisany do cDNA za pomocą Super-Script first-strand synthesis system (TransGen) zgodnie z instrukcjami producenta., CDNA był używany jako szablon do wykonywania PCR w czasie rzeczywistym z podkładami specyficznymi dla genów (dodatkowy plik 1: Table S1) i SYBR Green Mix (Takara) w systemie wykrywania PCR w czasie rzeczywistym Cfx96 TouchTM (Bio-Rad). Gen aktyny był stosowany jako wewnętrzna normalizacja w próbkach. Zmienność ekspresji genów obliczono na podstawie wartości ΔΔCt.

ekstrakcja białek i analizy SDS-PAGE

rozpuszczalne frakcje białkowe liści, MCPs i GCP zostały przygotowane według Li i Assmanna . Wszystkie kolejne kroki wykonywano w temperaturze 4 °C., Proszek protoplastów i liści zmieszany z 40 µl lodowatego buforu w probówkach mikrofugowych. Bufor wynosił 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mm MgCl2, 2 mm kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 0,25 mM kwas glikolotetraoctowy (EGTA), 250 mM sacharozę, 2 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) i 10 µg ml−1 każdego z inhibitorów proteazy-leupeptyny, pepstatyny i aprotyniny. Homogenit był przechowywany na lodzie przez 20 min, a następnie odwirowany w temperaturze 10 000×g przez 15 min, a supernatant był używany do 10% SDS-PAGE. Stężenia białka zostały zmierzone za pomocą zestawów Brandforda.