croissance des plantes

des graines de tomate CM (Castlemart, type sauvage) ont germé et ont été cultivées dans une chambre de croissance sous 18 h de lumière à 27 °C et 6 h de noir à 18 °C en culture hydroponique ou sur substrat. Des plantes avec de vraies feuilles expansées saines ont été récoltées pour la préparation de GCPs (fichier supplémentaire 1: Fig. S1 et Fig. 1)., Les fragments épidermiques de vraies feuilles ont été prélevés comme décrit pour la méthode L ou la méthode S.

garder les cellules à différents stades de la digestion enzymatique dans la méthode L (a–c) et la méthode s (d–l). A-f sept feuilles entièrement expansées des plantes hydroponiques sélectionnées pour l’isolement GCPs (fichier supplémentaire 1: Fig. S1). G-I sept feuilles entièrement expansées des plantes de culture de substrat sélectionnées pour l’isolement de GCPs., j – L quatre feuilles complètement élargies des plantes hydroponiques (plantes plus jeunes que d–f) sélectionnées pour l’isolement par GCPs. a, d, h, k le statut de GCs après 1,5, 0,5, 2 et 0,5 h de digestion dans la solution enzymatique 1. b, e le statut de GCs après 2 et 1 h de digestion dans la solution enzymatique 2. c, f, i, l le statut de GCs après 3,5, 2,5, 4,5 et 1,5 h de digestion dans la solution enzymatique 2. Les barres de tartre indiquent 20 µm

préparation des PCG: méthode L

Les vraies feuilles entièrement dilatées (pesées ~ 10 g) ont été récoltées à partir de plants de tomates hydroponiques., Ensuite, les feuilles ont été mélangées pendant 1 min (trois impulsions de 20 s) dans un mélangeur (18 000 tr/min) dans 250 ml d’eau distillée froide. Le mélange de feuilles mélangé a été versé à travers une maille de nylon de 74 µm pour éliminer les cellules de mésophylle cassées et rincé plusieurs fois avec de l’eau distillée froide jusqu’à ce que la majeure partie de la mousse produite par le mélange ait largement disparu et que les fragments épidermiques soient vert pâle. Ensuite, les tissus épidermiques ont été transférés dans un flacon contenant 50 ml de solution enzymatique 1 qui a été incubé pendant 1,5 h à 27 °C dans un bain d’eau agitant dans l’obscurité, avec la vitesse de secousse réglée à 100 tr / min., Après 1,5 h d’incubation, des fragments épidermiques ont été collectés sur une maille de nylon de 58 µm, rincés doucement avec du milieu basique 2 et transférés dans 50 ml de solution enzymatique 2 dans un flacon. Cette solution contenant les fragments a ensuite été incubée à 25 °C dans un bain-marie agitant (70 tr / min) jusqu’à ce que la plupart des PCG soient libérées, généralement après environ 3,5 H. pour améliorer la libération des PCG des pelures épidermiques, le ballon a été tourbillonné doucement à la main pendant quelques secondes à la fin de la digestion. , De plus, les pelures dans la solution enzymatique ont été passées doucement plusieurs fois à travers une pipette équipée d’une pointe de 5 ml qui a été coupée pour libérer les PCG. L’effet de l’enzymolyse a été évalué au microscope. Le deuxième mélange de digestion enzymatique a été filtré à travers une maille de nylon de 37 µm. Les tissus épidermiques sur la maille ont été rincés avec du milieu basique 2 pour libérer davantage de PCG. La solution enzymatique contenant les protoplastes a ensuite été filtrée à travers une maille de nylon de 15 µm, et les PCG libérés ont été collectés (dans des tubes à centrifuger de 50 ml) par centrifugation pendant 6 min à 300×g., Les PCG ont été lavés trois fois avec le milieu de base 2 pour garder les PCG exempts de la pastille de cellules mélangées et d’autres débris. Après avoir retiré le surnageant, un volume de 5 ml de protoplastes a été produit, qui a été stocké à 4 °C dans l’obscurité pour la purification suivante ou pour d’autres expériences.

préparation des PCG: méthode S

ce protocole a été dérivé de la « méthode L”, avec une modification impliquant la composition de la solution enzymatique 1. La solution enzymatique 1 se compose de 1,0% (p/v) de cellulose « ONOZUKA” RS, de 0,01% (p/v) de Pectolyase Y-23, de 0,1% (p/v) de PVP-40, de 0,25% (p/v) d’albumine sérique bovine et de 0.,5 mm acide L-ascorbique, dissous en milieu basique 1. L’amélioration de la méthode S a réduit le temps requis de 2 h par rapport à la méthode L. La première digestion enzymatique ne nécessite que 0,5 h, tandis que la seconde digestion enzymatique nécessite 2,5 h et 1,5 h (avec les jeunes plants Fig. 1).

Purification des PCG

pour éliminer les fragments de tissu vasculaire et les contaminants des PCG, une étape supplémentaire de purification a été effectuée qui améliore considérablement la pureté des PCG., Le protocole de purification du GCPs était conforme à celui des méthodes précédentes , avec des modifications adaptées pour la tomate décrites ici. La solution de base 2 a été ajoutée à la suspension GCPs pour donner un volume final de 8 ml. Six millilitres D’Histopaque (No. 1077, Sigma-Aldrich) ont été soigneusement pipetés dans le fond d’un tube à centrifuger. Les PCG ont ensuite été soigneusement superposés au-dessus de l’Histopaque. Les tubes ont été centrifugés pendant 20 min à 150×g, après quoi les Pcgp ont été collectés à l’interface des deux solutions avec une pipette Pasteur et transférés dans un nouveau tube à essai., Les Pcgv ont été dilués avec la solution basique 2, puis les tubes ont été centrifugés pendant 6 min à 300×g. Le surnageant a été retiré et les Pcgv isolés ont été remis en suspension dans 1 ml de solution basique 2 et maintenus sur de la glace dans l’obscurité jusqu’aux essais ultérieurs.

évaluation de la viabilité des protoplastes

la viabilité des PCG a été évaluée par des mesures de fluorescence avec le diacétate de fluorescéine (FDA). L’hydrolyse du colorant a été observée après mélange de GCPs avec le mélange d’incubation pendant 5 min. La concentration opérationnelle de la FDA était de 0,01% (p/v) dissous dans l’acétone., Les préparations de protoplastes ont été vues et imagées à l’aide d’un microscope à fluorescence Zeiss Axio Observer D1 avec excitation bleue à l’aide de la combinaison de filtres FITC.

préparation de MCPs

La méthode d’isolement de Solanum lycopersicum est modifiée par rapport à celle décrite par Romano et al. . Les feuilles entièrement expansées sont coupées en morceaux de 0,5 cm2. Les morceaux de feuilles sont ensuite transférés dans 30 ml de solution enzymatique: 5 mM Mes, 0,65 m D-mannitol, 1 mM CaCl2, 0,5% (w: v) Macérozyme R-10 (Yakult, Japon), 1% (w: V) Cellulase R-10 (Yakult, Japon), 0,25% (w: V) BSA et 0,1% (w: v) PVP-40, pH 5,5 (KOH)., La Digestion est effectuée à 25 °C pendant 2 h avec agitation lente (40 excursions par min) dans un bain d’eau. La solution enzymatique devient verte après un léger mouvement tourbillonnant, indiquant la libération de protoplastes. Le temps de Digestion dépend des objectifs expérimentaux et des matériaux utilisés. Il n’est pas nécessaire de libérer tous les protoplastes des morceaux de feuilles. La solution est filtrée à travers une maille de nylon de 37 µm dans un tube à centrifuger de 50 ml. Les morceaux de feuilles retenus sont rincés avec 20 ml de milieu d’incubation (0,65 m de D-mannitol, 1 mM de CaCl2) et le filtrat est également collecté., Les MCP libérés ont été collectés par centrifugation pendant 5 min à 100×g. La pastille a été lavée trois fois avec 0,65 m de D-mannitol contenant 1 mM de CaCl2. Les MCP isolés ont été stockés sur de la glace dans l’obscurité jusqu’à leur utilisation.

analyses semi-quantitatives par PCR à transcription inverse

L’ARN Total a été extrait des PCG et des protoplastes de cellules mésophylliennes (MCP) à L’aide du kit D’isolement D’ARN Arcturus PicoPure (Applied Biosystems, Cat no. 12204-01, USA) selon le protocole du fabricant., L’ARN Total a été transcrit de manière inverse en ADNc à l’aide du Super-Script first-strand synthesis system (TransGen Biotech) selon les instructions du fabricant. La RT-PCR Semi-quantitative a été réalisée avec deux gènes qui ont été spécifiquement exprimés dans des cellules de garde ou des cellules de mésophylle pour évaluer la pureté des protoplastes. Le gène de L’actine (amorce avant, 5′-CCTCTCAGTTCCGTTGAATAG-3′; amorce inverse, 5′-TCACCAGAGAGTCCAACACAA TAC-3′) a été utilisé comme témoin pour des expériences de RT-PCR., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

analyses quantitatives par PCR en temps réel (qRT-PCR)

la qRT-PCR a été réalisée avec quatre gènes qui ont été préférentiellement exprimés dans les cellules de garde ou représentés comme régulateurs de la réponse ABA et ont montré une induction ou une répression au niveau de la transcription en réponse à MeJA dans les cellules de garde. Suspension GCPs incubée dans des tubes à microfuge de 1,5 ml à température ambiante pendant 10 min, puis traitée avec 50 µM ± MeJA (concentration finale) pendant 5, 10, 15, 20 min. Après l’incubation, les cellules de garde ont été collectées simultanément, congelées et stockées à − 80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie., Considérant que le protoplasting induit l’expression de gènes associés au stress, deux inhibiteurs de transcription différents, l’actinomycine D (33 mg/L) et la Cordycépine (100 mg/L), ont été utilisés dans toutes les procédures d’isolement, y compris la première étape du mélange . Les analyses qRT-PCR de l’expression précoce des gènes de réponse à la plaie avec ou sans inhibiteurs de la transcription ont été effectuées.

L’ARN Total a été isolé des PCG à L’aide du kit D’isolement D’ARN Arcturus PicoPure (Applied Biosystems, Cat no. 12204-01, USA) selon le protocole du fabricant., Tous les échantillons D’ARN ont été digérés avec de la DNase sans RNase pour éliminer L’ADN génomique. La qualité et la concentration de chacun des échantillons D’ARN ont été déterminées à l’aide du spectrophotomètre Namedrop 2000 (Thermo Scientific). L’intégrité de l’ARN a également été vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose. Pour la PCR en temps réel, L’ARN total a été transcrit de manière inverse en ADNc à l’aide du Super-Script first-strand synthesis system (TransGen Biotech) selon les instructions du fabricant., L’ADNc a été utilisé comme modèle pour effectuer une PCR en temps réel avec des amorces spécifiques au gène (fichier supplémentaire 1: Tableau S1) et SYBR Green Mix (TaKaRa) dans un système de détection PCR en temps réel CFX96 TouchTM (Bio-Rad). Le gène de l’actine a été utilisé comme normalisation interne dans les échantillons. Le changement de pli dans l’expression des gènes a été calculé à l’aide de valeurs ΔΔCt.

extraction de protéines et analyses SDS-PAGE

des fractions protéiques solubles de feuilles, de MCP et de GCP ont été préparées selon Li et Assmann . Toutes les étapes suivantes ont été effectuées à 4 °C., Protoplastes et poudre de feuilles mélangées à 40 µl de tampon glacé dans des tubes à microfugeants. Le tampon était 50 mM Tris–HCl, pH 7,5, 1 mM MgCl2, 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,25 mM d’acide éthylèneglycoltétraacétique (EGTA), 250 mM de saccharose, 2 mM de dithiothréitol (DTT), 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et 10 µg ml−1 chacun des inhibiteurs de la protéase leupeptine, pepstatine et aprotinine. L’homogénat a été conservé sur de la glace pendant 20 min, puis centrifugé à 10 000×g pendant 15 min et le surnageant a été utilisé pour 10% SDS-PAGE. Les concentrations de protéines ont été mesurées par les Kits Brandford.