muitas aplicações biológicas, tais como microbiologia, cultura celular, trabalho sanguíneo e muitos outros que usam células requerem que determinemos a concentração celular para o nosso experimento.a contagem de células é bastante simples e requer uma câmara de contagem chamada hemocitómetro, um dispositivo inventado pelo anatomista francês Louis-Charles Malassez do século XIX para realizar contagens de células sanguíneas. Um hemocitómetro consiste numa lâmina espessa de microscópio de vidro com uma grelha de linhas perpendiculares gravadas no meio., A grade especificou as dimensões para que a área coberta pelas linhas seja conhecida, o que torna possível contar o número de células em um volume específico de solução.

Figura 1. Um Hemocitómetro clássico

o tipo mais comum de hemocitómetro tem uma forma “H” gravada no meio que encerra duas superfícies polidas em forma de espelho separadas e fornece a área de montagem do deslizamento de cobertura (Figura 1).,Antes de iniciar, certifique-se de que tanto o hemocitómetro como a sua cobertura estão limpos, removendo quaisquer partículas de poeira com papel de lente. As tampas de cobertura que são utilizadas para montagem em hemocitómetros são especialmente feitas para serem mais espessas do que as tampas de microscopia convencional, porque eles devem ser capazes de superar a tensão superficial de uma gota de líquido.Antes de carregar a suspensão celular, certifique-se de colocar primeiro a tampa de cobertura sobre a superfície de contagem., Em seguida, coloque a ponta da pipeta com a sua amostra num dos poços em forma de V, Como Na Figura 2, e expulse suavemente a amostra. A área sob a cobertura preenche-se por acção capilar. Deve introduzir-se líquido suficiente para que a superfície espelhada seja apenas coberta, geralmente cerca de 10 µl, mas não sobreforte a superfície. Pode carregar duas amostras num hemocitómetro, uma em cada uma das grelhas.

Figura 2., A carga do Hemocitómetro

o hemocitómetro carregado é então colocado na fase do microscópio e a grelha de contagem é colocada em foco a baixa potência. Permitir que a amostra se estabilize por um par de minutos e evitar mover o revestimento, pois pode introduzir bolhas de ar e tornar a contagem difícil.

Contagem de células num hemocitómetro

a grelha completa num hemocitómetro contém nove quadrados, cada um dos quais é de 1 mm2 (Figura 3). A área de contagem central do hemocitómetro (figura 3B) contém 25 quadrados grandes e cada quadrado grande tem 16 quadrados menores., Ao contar, conte apenas as células nas linhas de dois lados do quadrado grande para evitar a contagem de células duas vezes (figura 3G). As suspensões devem ser suficientemente diluídas para que as células ou outras partículas não se sobreponham na grelha e sejam uniformemente distribuídas.

Figura 3. Contagem de células no Hemocitómetro.

para distinguir entre células mortas e viáveis, a amostra é muitas vezes diluída com uma mancha particular, como o azul de Trypan., Este método de coloração, também conhecido como coloração de exclusão de corantes, usa um corante diazo que penetra seletivamente membranas celulares de células mortas, colorindo-as de azul, enquanto que não é absorvido por membranas de células vivas, excluindo assim as células vivas de coloração. Quando vistas ao microscópio, as células mortas aparecem como azul escuro (Figura 4)

Figura 4. Exclusão azul de tripan de células vivas no Hemocitómetro. (A seta indica absorção de corante através da membrana de células mortas.,)

Para realizar a contagem, determinar a ampliação necessária para reconhecer o tipo de célula desejada e sistemática de contagem de células em quadrados selecionados de modo que a contagem total é de cerca de 100 células, um número mínimo de células necessárias para um resultado estatisticamente significativo de contagem.

para células grandes, pode simplesmente contar as células dentro dos quatro grandes quadrados de canto (figura 3C-F) e do meio (figura 3B). Para uma suspensão densa de pequenas células, você pode querer contar as células nos quatro quadrados externos e médios do quadrado central (figura 3B) ou fazer uma suspensão mais diluída.,

lembre-se se uma célula sobrepõe uma decisão, conte-a como “em” se sobrepuser a decisão superior ou direita, e “para fora” se sobrepuser a decisão inferior ou esquerda (figura 3G).

A área de meio (Figura 3B), e a cada canto do quadrado (Figura 3C-F) é de 1 mm x 1 mm = 1 mm2: a profundidade de cada quadrado é de 0,1 mm. O volume final de cada quadrado, em que a profundidade é 100nl.,

uma Vez que você tenha obtido o total de contagem de células, a célula de concentração pode ser calculada a partir da fórmula a seguir:

Assim, por exemplo, se sua amostra diluída 1:1 com a Trip azul, e você contados 325 células em 4 praças canto mais o centro de grande praça, total de células por ml =

Se você deseja saber quantas células tem em sua amostra original, basta multiplicar a célula de concentração por volume total da amostra. Por exemplo, se o volume original da amostra for de 5 ml, Então a sua amostra tem um total =