exakt genomreplikation är avgörande för livskraften hos någon organism. Det allmänna konceptet för kopiering av DNA var uppenbart vid klargörandet av DNA: s dubbla spiralstruktur och identifieringen av basparkomplementaritet (1): en sträng nukleobaser kunde fungera som mallen för syntes av en ny sträng. Inom ett decennium av dessa upptäckter renades ett medel från E. coli som katalyserade DNA-strängduplicering (2). Detta medel kallades en ”polymeras”. E., coli DNA polymeras I, den första DNA polymeras upptäcktes var inte den primära replikativa polymeras, utan i stället en involverad i släpar sträng Okazaki fragment upplösning och DNA reparation. Detta förebådade framtida upptäckter av många DNA-polymerasfamiljer, var och en betjänar specifika cellulära krav på DNA-replikering och reparation.

DNA-polymeraser fungerar som grundläggande enzymer i biovetenskapen av samma anledning som de är kritiska i naturen: de kopierar DNA. Polymerasapplikationer inkluderar DNA-märkning, sekvensering och förstärkning., Ett specifikt amplifieringsprotokoll, polymeraskedjereaktionen (PCR) är en allmänt använd teknik som använder termofila polymeraser för att exponentiellt förstärka specifika DNA-segment (3) och möjliggör en rad tillämpningar från human och patogen diagnostik till molekylär kloning i biologi labs runt om i världen.

Polymerasnoggrannhet

PCR ställer samma grundläggande krav på ett polymeras som en cell sätter på sitt replikationssystem. I huvudsak bör polymerasen vara tillförlitlig, noggrann och snabb., Polymeras noggrannhet eller ”trohet” avser benägenheten att införliva rätt nukleotid som anges av mallsträngen. De vanliga PCR-enzymerna är inte överraskande ganska exakta. Även Thermus aquaticus (Taq) DNA polymeras, anses vara en låg trohet PCR polymeras, bara gör ett misstag en gång i ungefär nukleotid Infogningar (12)., Polymerase discovery and engineering ansträngningar har producerat HiFi polymerases, som sällan gör baser substitution misstag, kräver DNA sekvenseringsmetoder för att läsa miljontals syntetiserade baser för att upptäcka eventuella fel av polymerase framsteg i mätning trohet genom enmolekyl sekvensering har identifierat Q5® High-Fidelity DNA Polymerase som att ha trohet 280X större thanTaq DNA polymerase (12).,

kontrollpunkter för trohet: geometriskt urval på den aktiva platsen och bortom

DNA-polymeraser säkerställer korrekt replikering Med hjälp av en serie molekylära kontrollpunkter, på platsen för nukleotidinkorporering och därefter (1). Under nukleotidtillsatsen är den korrekta inkommande nukleotiden placerad för en produktiv anpassning av katalytiska grupper, vilket säkerställer effektiv införlivande. Denna justering för katalys är känslig för snedvridningar i läge som orsakas av felaktig Watson-Crick – basparning, vilket möjliggör kinetisk stallning vid felaktiga eller icke-kognitiva baspar.,

korrekturläsning av DNA-polymeraser

en annan metod för att öka trohet är att polymerasen har 3→5 exonukleasaktivitet, kallas ”korrekturläsning”. Med hjälp av bas-parning och aktiv plats molekylära kontrollpunkter som beskrivs ovan, Taq DNA polymeras är otroligt exakt, men korrekturläsning enzymer kan ha ännu högre trohet. Denna extra noggrannhet förmedlas via korrekturläsning, med polymeras ”kontroll” om rätt nukleotid har införts i mallen., Om en obalans upptäcks överförs DNA från polymerisationsdomänen till en N-terminal 3→5-exonukleasdomän av polymerasen. Den felaktigt införlivade nukleotiden skärs ut, DNA rör sig tillbaka till polymerisationsdomänen och kopiering kan återupptas (Figur 2).

bakteriofag T4 visade sig vara ett användbart experimentellt system för att utvärdera vikten av 3→5 exonukleasaktivitet för korrekt DNA-replikation (6). Mutationer i T4-genen 43 (som kodar för DNA-polymerasen) identifierades som antingen minskade eller ökade trohet. Genom att definiera ett exonukleas/polymeras (n/P) – aktivitetsförhållande för ett mutantenzym konstaterades att polymeraser med låga n/P-förhållanden var mer felbenägna än de med höga n / P-förhållanden., En förklaring till denna observation är att vid införlivande av en missmatchad bas är det mer sannolikt att exonukleaset kommer att avlägsna nukleotiden innan polymerasaktiviteten förlänger den i enzymer med högre n/P-förhållanden. Intressant kan den korrekturläsande effektiviteten hos ett polymeras visa sekvensberoende. Till exempel är AT-rika sekvenser mer effektivt korrekturläsa än GC-regioner. Denna diskrepans anses bero på den lägre stabiliteten i AT-regioner som underlättar strängsmältning och därmed korrekturläsning aktivitet.,

frånvaron av 3→5 exonukleasaktivitet kan ha andra konsekvenser än trohet i PCR. Bristen på korrekturläsning aktivitet i Taq DNA polymeras har föreslagits för att begränsa amplicon storlek möjligt med detta enzym (7). Generellt fungerar Taq bäst när man förstärker DNA-fragment < 2 kb, och kan arbeta med fragment upp till 3-4 kb. När den hålls till denna amplicon-storlek är Taq ett robust, lätt optimerat enzym. Men över ~3 kb faller det snabbt i effektivitet., Under PCR kommer Taq att misincorporate nukleotider och producera felaktigheter, där den är benägen att Stalla och är mer sannolikt att dissociera innan den sträcker sig jämfört med korrekt basparade 3-ändar. Därför, vid en viss amplicon storlek och polymeras felfrekvens tillräckligt missmatchade 3 ändar kan ansamlas för att effektivt hämma PCR-processen. Dessa missmatchade 3-ändar är särskilt problematiska för Taq eftersom det saknar 3→5-exonukleasaktiviteten för att ta bort dem., Genom tillsats i en liten mängd korrekturläsande enzym såsom Deep Vent®DNA polymeras, kan amplifiering av fragment ≥ 20 kb uppnås (Figur 3). Eftersom den stora majoriteten av enzymet i blandningen är Taq DNA-polymeras gör det förmodligen huvuddelen av primerförlängningen, med det korrekturläsande djupa Ventilationspolymeraset som tar bort de hämmande 3-felmatchningarna som genereras av Taq.,

Polymeraseprocessivitet

vikten av korrekturläsning aktivitet för PCR har varit allmänt känd i nästan två decennier, men en annan egenskap, processivitet, har fått ökad uppmärksamhet., ”Processivitet” är en term som refererar till antalet nukleotider som ingår i ett polymeras i en enda bindande händelse (före dissociation). Taq DNA polymeras tillför cirka 50 nukleotider per bindningshändelse (8). Varför spelar det någon roll? En låg-processivitet eller ”distributiv” polymeras förlänger en population av mallar på ett märkbart annorlunda sätt än en processiv polymeras. En mycket distributiv polymeras binder till en mall, lägger till ett par nukleotider, och dissocierar, lämnar en population av mallar som kan förlängas lika med tiden., En mycket processiv polymeras binder en mall och sträcker sig med längre bindande händelser.

det skulle följa att med tillräckligt med tid skulle resultatet av antingen en processiv eller distributiv polymerasreaktion vara en population av kopierade mallar. Under vissa omständigheter är det emellertid möjligt att processiv polymeras har överlägsen prestanda. Subenheten E. coli polymeras III α, En del av det huvudsakliga replikativa polymeraset, har en processivitet av < 10 baspar och en hastighet av < 20 nukleotider/sekund (nt/s)., Men när underenheten associerar med de andra replisome-underenheterna, särskilt glidklämman, ökar den effektiva processiviteten och replikationshastigheten till > 50 kb respektive 1,000 nt/s (9). Termen ”effektiv processivitet” används eftersom det finns data som indikerar att polymeras-subenheten kan utbyta i replisomen, men replisomen upprätthåller snabb, processiv DNA-replikation (10).

för att dra nytta av processivitet i PCR har forskare smält en DNA-bindande domän till en archaeal polymeras (11)., Detta chimära enzym har flera förbättrade egenskaper, men framför allt kan det förstärka DNA med kortare förlängningstider och producera längre DNA-produkter mer effektivt, vilket förkortar totala termocyklingstider. Denna fusionsidé är grunden för Q5 High-Fidelity DNA polymeras och Phusion® High-Fidelity DNA polymeras, två polymeraser tillgängliga från NEB (Figur 4).

framtida riktningar

många egenskaper påverkar effekten och nyttan av ett PCR-polymeras. Polymerase active site architecture och korrekturläsning aktivitet påverkar noggrannheten hos den slutliga produkten. Polymerasblandningar och fusion till ett DNA-bindande protein ger överlägsen PCR-prestanda för amplicon längd och, när det gäller chimera, reaktionshastighet., Andra viktiga framsteg inom PCR, såsom hot-start polymeraser för att öka reaktionsspecificitet, multiplex PCR (Figur 5) och qPCR har också revolutionerat livsvetenskaperna.

som demonstreras av konstruerade blandningar och chimärer kan egenskaperna hos själva polymerasen moduleras för att förbättra PCR-prestanda. I framtiden är det troligt att polymerasegenskaperna i allt högre grad kommer att anpassas till specifika PCR-tillämpningar, och detta är därför ett viktigt forskningsområde vid NEB.,

visa NEBS DNA Polymerase Selection Chart