många biologiska tillämpningar som mikrobiologi, cellodling, blodarbete och många andra som använder celler kräver att vi bestämmer cellkoncentrationen för vårt experiment.

cellräkning är ganska enkelt och kräver en räkningskammare som kallas en hemocytometer, en enhet som uppfanns av 1800-talets franska anatomisten Louis-Charles Malassez för att utföra blodcellsantal. En hemocytometer består av ett tjockt glasmikroskopglas med ett rutnät av vinkelräta linjer etsade i mitten., Rutnätet har specificerade dimensioner så att det område som omfattas av linjerna är känt, vilket gör det möjligt att räkna antalet celler i en specifik volym lösning.

Figur 1. En klassisk Hemocytometer

den vanligaste typen av hemocytometer har en ” H ” – form graverad i mitten som omsluter två separata spegelliknande polerade gallerytor och ger täckglasmonteringsområdet (Figur 1).,

ladda hemocytometern

innan du börjar se till att både hemocytometern och dess täckglas är rena genom att ta bort eventuella dammpartiklar med linspapper. Coverslips som används för montering på hemocytometrar är speciellt gjorda för att vara tjockare än de konventionella mikroskopiska täckglasen eftersom de måste kunna övervinna ytspänningen hos en droppe vätska.

se till att först placera täckglaset över räkningsytan innan du laddar cellsuspensionen., Placera sedan pipettspetsen med provet i en av de V-formade brunnarna, som i Figur 2, och utvisa försiktigt provet. Området under täckglaset fylls med kapillärverkan. Tillräckligt med vätska bör införas så att den speglade ytan bara är täckt, vanligtvis runt 10 µl, men överfyll inte ytan. Du kan ladda två prover på en hemocytometer, en i var och en av de två gallren.

Figur 2., Laddar Hemocytometern

den laddade hemocytometern placeras sedan på mikroskopstadiet och räkningsnätet sätts i fokus vid låg effekt. Låt provet lösa sig i några minuter och undvik att flytta täckglaset eftersom det kan leda till luftbubblor och göra det svårt att räkna.

räkna celler i en hemocytometer

hela nätet på en hemocytometer innehåller nio rutor, som var och en är 1 mm2 (Figur 3). Den centrala räkningsområdet för hemocytometern (figur 3b) innehåller 25 stora rutor och varje stor kvadrat har 16 mindre rutor., När du räknar, räkna bara de cellerna på linjerna på två sidor av den stora torget för att undvika att räkna celler två gånger (figur 3G). Suspensioner bör spädas tillräckligt så att cellerna eller andra partiklar inte överlappar varandra på gallret och ska fördelas jämnt.

Figur 3. Räkna celler på Hemocytometern.

för att skilja mellan döda och livskraftiga celler späds provet ofta med en viss fläck, såsom Trypanblå., Denna färgningsmetod, även känd som färgämne uteslutning färgning, använder en diazo färgämne som selektivt penetrerar cellmembran av döda celler, färga dem blå, medan det inte absorberas av membran av levande celler, vilket utesluter levande celler från färgning. När de ses under ett mikroskop, skulle döda celler visas som mörkblå (Figur 4)

Figur 4. Trypan blå uteslutning av levande celler på Hemocytometern. (Pil indikerar upptag av färgämne över membranet av döda celler.,)

för att utföra räkningen, bestämma förstoringen som behövs för att känna igen den önskade celltypen och systematiskt räkna cellerna i valda rutor så att det totala antalet är cirka 100 celler, ett minimalt antal celler som behövs för ett statistiskt signifikant antal.

för stora celler kan du helt enkelt räkna cellerna inuti de fyra stora hörnrutorna (figur 3C-F) och den mellersta (figur 3b). För en tät suspension av små celler kanske du vill räkna cellerna i de fyra yttre och mellersta kvadraterna på den centrala torget (figur 3b) eller göra en mer utspädd suspension.,

Kom ihåg om en cell överlappar en dom, räkna den som ” i ”om den överlappar den övre eller högra domen och” ut ” om den överlappar den nedre eller vänstra domen (figur 3G).

området i mitten (figur 3b) och varje hörn kvadrat (figur 3C-F) är 1 mm x 1 mm = 1 mm2: djupet på varje kvadrat är 0,1 mm. Den slutliga volymen av varje kvadrat på det djupet är 100nl. ,

När du har fått det totala cellantalet kan cellkoncentrationen beräknas med följande formel:

så, till exempel, om du spädde ut ditt prov 1:1 med Trypanblå, och du räknade 325 celler i 4 hörnrutor plus det centrala Stora torget, totala celler per ml =

om du vill veta hur många celler du har i ditt ursprungliga prov, multiplicera bara cellkoncentrationen med total provvolym. Till exempel, om din ursprungliga provvolym är 5 ml, har ditt prov totalt =