Abstrakt

DNA-ligas av E. coli är en polypeptid av molekylvikt 75 000. Det jämförbara T4-inducerade enzymet är något mindre (63 000 till 68 000). Båda enzymerna katalyserar syntesen av fosfodiesterbindningar mellan angränsande 5 ’- fosforyl-och 3 ’ – hydroxylgrupper i nickad duplex-DNA, kopplad till klyvningen av pyrofosfatbindningen av DPN (E. coli) eller ATP (T4)., Fosfodiesterbindningssyntes katalyserad av båda enzymerna sker i en serie av dessa diskreta steg och involverar deltagande av två kovalenta mellanprodukter (Fig. 1). En steady state kinetisk analys av reaktionskatalyserad E. coli-ligas stöder denna mekanism och visar vidare att enzymadenylat och DNA-adenylat är kinetiskt signifikanta mellanprodukter på den direkta vägen för fosfodiesterbindningssyntes.

en stam av E. coli med en mutation i den strukturella genen för DNA-ligas som resulterar i syntesen av ett onormalt termolabilt enzym är oföränderlig vid 42 ° C., Även om den kan växa vid 30°C, är mutanten fortfarande defekt vid denna temperatur i sin förmåga att reparera skador på dess DNA som orsakas av ultraviolett bestrålning och av alkylerande medel. Vid 42 ° C är allt nyreplikerat DNA i form av korta 10s ”Okazaki-fragment”, en indikation på att orsaken till mutantens misslyckande att överleva under dessa förhållanden är dess oförmåga att upprätthålla ligationssteget som är väsentligt för den diskontinuerliga syntesen av E. coli-kromosomen. DNA-ligas är därför ett viktigt enzym som krävs för normal DNA-replikering och reparation i E. coli., Renade DNA-ligaser har visat sig vara användbara reagens i konstruktionen in vitro av rekombinanta DNA-molekyler.