plantevækst

Frø af tomat CM (Castlemart, wild-type) blev spiret og vokset i en vækst kammer under 18 h af lys på 27 °C og 6 timer af mørkt ved 18 °C i hydroponics substrat eller kultur. Planter med sunde udvidede ægte blade blev høstet til forberedelse af GCP ‘ er (yderligere fil 1: Fig. S1 og Fig. 1)., Epidermal fragmenter af ægte blade blev indsamlet som beskrevet for Metode L eller Metode S.

Vagt celler på forskellige stadier af enzymatiske fordøjelse i Metode L (a–c) og Metode S (d–l). A-F syv fuldt udvidede blade af de hydroponiske planter, der er valgt til gcps-isolering (yderligere fil 1: fig. S1). g-i syv fuldt udvidede blade af substratet kulturplanter valgt til gcps isolation., J-l fire fuldt udvidede blade af de hydroponiske planter (yngre planter sammenlignet med d–F) valgt til gcps-isolering. A, D, H, k status for GCs efter 1,5, 0,5, 2 og 0,5 h fordøjelse i en .ymopløsning 1. B, E status for GCs efter 2 og 1 time af fordøjelsen i en .ymopløsning 2. C, F, i, l status for GCs efter 3,5, 2,5, 4,5 og 1,5 h fordøjelse i en .ymopløsning 2. Skala barer indikerer, 20 µm

Forberedelse af GCPs: Metode L

Den fuldt udbygget rigtige blade (vejet ~ 10 g) blev høstet fra hydroponiske tomat planter., Derefter blev bladene blandet i 1 min (tre pulser på 20 s) i en blender (18.000 o/min) i 250 ml koldt destilleret vand. Den blandede bladblanding blev hældt gennem et 74-µm nylonnet for at fjerne ødelagte mesophyll-celler og skyllet flere gange med koldt destilleret vand, indtil det meste af skummet produceret ved blanding stort set var forsvundet, og de epidermale fragmenter var lysegrønne. Derefter blev det epidermale væv overført til en kolbe indeholdende 50 ml en .ymopløsning 1, der blev inkuberet i 1, 5 h ved 27.C i et rystende vandbad i mørke, med rystehastigheden indstillet til 100 o / min., Efter 1,5 timers inkubation blev epidermale fragmenter opsamlet på et 58-µm nylonnet, skyllet forsigtigt med basismedium 2 og overført til 50 ml en .ymopløsning 2 i en kolbe. Denne løsning indeholder fragmenter blev derefter inkuberes ved 25 °C i en rystevandbad (70 rpm), indtil det meste af GCPs blev udgivet, typisk efter ca 3,5 h. For at forbedre frigivelse af GCPs fra epidermal skræl, skylles var hvirvles forsigtigt i hånden i et par sekunder i slutningen af fordøjelsen., Derudover blev skrælningerne i en .ymopløsningen forsigtigt ført flere gange gennem en pipetter udstyret med en 5 ml spids, der blev skåret for at frigive GCP ‘ erne. En .ymolyseeffekten blev vurderet under et mikroskop. Den anden en .ymfordøjelsesblanding blev filtreret gennem 37-µm nylonnet. De epidermale væv på masken blev skyllet med basismedium 2 For yderligere frigivelse af GCP ‘ er. En .ymopløsningen indeholdende protoplasterne blev derefter filtreret gennem et 15-µm nylonnet, og de frigivne GCP ‘ er blev opsamlet (i 50 ml centrifugerør) ved centrifugering i 6 minutter ved 300.g., GCP ‘erne blev vasket tre gange med basismedium 2 for at holde GCP’ erne fri for pellet af blandede celler og andet affald. Efter fjernelse af supernatanten blev der givet et volumen på 5 ml protoplaster, som blev opbevaret ved 4.C i mørket til den næste oprensning eller til andre forsøg.

fremstilling af GCP ‘ er: Metode s

denne protokol blev afledt af “metode L”, med en modifikation, der involverer sammensætningen af en .ymopløsning 1. Enzym løsning 1 består af 1,0% (w/v) cellulose “Onozuka” RS, 0.01% (w/v) Pectolyase Y-23, 0,1% (w/v) PVP-40, 0.25% (w/v), bovin serum albumin og 0.,5 mM L-ascorbinsyre, opløst i basisk medium 1. Den forbedrede Metode, S reducerede den tid, der kræves ved 2 timer, sammenlignet med Metoden L. Det første enzym fordøjelsen har brug kun 0,5 h, mens det andet enzym fordøjelse behov 2,5 timer og 1,5 timer (med unge planter Fig. 1).

oprensning af GCP ‘er

for at fjerne fragmenter af vaskulært væv og forurenende stoffer fra GCP’ er blev der udført et yderligere rensningstrin, der signifikant forbedrer renheden af GCP ‘ erne., Rensningsprotokollen for GCP ‘ erne var ifølge den fra tidligere metoder, med modifikationer tilpasset til tomat beskrevet her. Basisopløsning 2 blev sat til gcps-suspensionen for at give et slutvolumen på 8 ml. Seks milliliter Histopa .ue (No. 1077, Sigma-Aldrich) blev omhyggeligt pipetteret i bunden af et centrifugerør. GCP ‘ erne blev derefter omhyggeligt lagdelt oven på Histopa .ue. Rørene blev centrifugeret i 20 minutter ved 150 150 g, hvorefter GCP ‘ erne blev opsamlet fra grænsefladen mellem de to opløsninger med en Pasteurpipette og overført til et nyt reagensglas., GCP ‘erne blev fortyndet med basisk opløsning 2, og derefter blev rørene centrifugeret i 6 minutter ved 300. g.supernatanten blev fjernet, og de isolerede GCP’ er blev resuspenderet i 1 ml basisk opløsning 2 og holdt på is i mørke indtil efterfølgende test.

vurdering af protoplast levedygtighed

levedygtigheden af GCP ‘ er blev evalueret ved fluorescensmålinger med fluoresceindiacetat (FDA). Farvestofhydrolysen blev observeret efter blanding af GCP ‘ er med inkubationsblandingen i 5 minutter. Driftskoncentrationen af FDA var 0,01% (w/v) opløst i acetone., Protoplastpræparater blev set og afbildet under anvendelse af et fluoreseiss a .io Observer D1 fluorescensmikroskop med blå e .citation ved hjælp af FITC-filterkombinationen.

fremstilling af MCPs

metoden til isolering af Solanum lycopersicum ændres fra den, der er beskrevet af Romano et al. . Fuldt udvidede blade skæres i 0,5 cm2 stykker. Bladet stykker er derefter overført til 30 ml enzym løsning: 5 mM Mes, 0,65 M D-mannitol, 1 mM CaCl2, 0.5% (w: v) Macerozyme R-10 (Yakult, Japan), 1% (w: v) Cellulase R-10 (Yakult, Japan), 0.25% (w: v) BSA og 0,1% (w: v) PVP-40, pH 5,5 (KOH)., Fordøjelsen udføres ved 25.C i 2 timer med langsom omrystning (40 udflugter pr. En .ymopløsningen bliver grøn efter blid hvirvlende bevægelse, hvilket indikerer frigivelse af protoplaster. Fordøjelsestiden afhænger af de eksperimentelle mål og anvendte materialer. Det er ikke nødvendigt at frigive alle protoplasterne fra bladstykker. Opløsningen filtreres gennem 37 um nylonnet i et 50 ml centrifugerør. De tilbageholdte bladstykker skylles med 20 ml inkubationsmedium (0,65 M D-mannitol, 1 mM CaCl2), og filtratet opsamles også., De frigivne MCP ‘ er blev opsamlet ved centrifugering i 5 minutter ved 100. g.pelleten blev vasket tre gange med 0,65 M D-mannitol indeholdende 1 mM CaCl2. Isolerede MCP ‘ er blev opbevaret på is i mørke indtil brug.

Semi-kvantitative reverse transkription PCR-analyser

Total RNA blev ekstraheret fra GCPs og mesophyll celle protoplasts (Mcp) ved hjælp af Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Kat. – nr. 12204-01, USA) i henhold til producentens protokol., Total RNA blev omvendt transkriberet til cDNA ved hjælp af Super-Script first-streng synthesis system (TransGen Biotech) i henhold til producentens anvisninger. Semikvantitativ RT-PCR blev udført med to gener, der specifikt blev udtrykt i beskyttelsesceller eller mesofylceller for at vurdere protoplastrenheden. Den Actin genet (frem primer, 5′-CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′; omvendt primer, 5′-TCACCAGAGTCCAACACAA TAC-3″) blev anvendt som kontrol for RT-PCR eksperimenter., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

Kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR) analyser

qRT-PCR blev udført med fire gener, der var fortrinsvis udtrykt i vagt celler eller afbildet som regulatorer af ABA svar og viste udskrift niveau induktion eller undertrykkelse i svar til MeJA i vagt celler. GCPs suspension inkuberes i 1,5 ml microfuge rør ved stuetemperatur i 10 minutter, og derefter behandlet med 50 µM, ± MeJA (endelig koncentration) for 5, 10, 15, 20 min. Efter inkubationen blev beskyttelsesceller opsamlet samtidigt, frosset og opbevaret ved − 80.C indtil yderligere analyse., I betragtning af, at protoplasting inducerer ekspressionen af stress-associerede gener, to forskellige transskription-hæmmere, actinomycin-D (33 mg/L) og cordycepin (100 mg/L), blev brugt i alle procedurer i isolation, herunder det første trin i en blanding . Analysesrt-PCR analyserne af tidlige sår-respons gener ekspression med eller uden transkription inhibitorer blev udført.

Total RNA blev isoleret fra GCPs, ved hjælp af Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Kat. – nr. 12204-01, USA) i henhold til producentens protokol., Alle RNA-prøver blev fordøjet med RNase-fri DNase for at fjerne genomisk DNA. Kvaliteten og koncentrationen af hver af RNA-prøverne blev bestemt ved anvendelse af Namedrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific). Integriteten af RNA blev også kontrolleret ved agarosegelelektroforese. For real-time PCR blev total RNA omvendt transkriberet til cDNA ved hjælp af Super-Script first-streng synthesis system (Transgenbiotek) i henhold til producentens anvisninger., Det cDNA, der blev brugt som en skabelon til at udføre real-time PCR med gen-specifikke primere (Ekstra fil 1: Tabel S1) og SYBR Green-Mix (TaKaRa) i en CFX96 TouchTM Real-Time PCR-detection system (Bio-Rad). Actin gen blev anvendt som en intern normalisering i prøver. Fold ændring i genekspression blev beregnet ved hjælp af valuescct værdier.

Proteinekstraktion og SDS-side analyser

opløselige proteinfraktioner af blade, MCP ‘er og GCP’ er blev fremstillet ifølge Li og Assmann . Alle efterfølgende trin blev udført ved 4 C. C., Protoplaster og blade pulver blandet med 40 µl iskold buffer i mikrofugerør. Den buffer, der var 50 mM Tris–HCl, pH 7,5, 1 mM MgCl2, 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,25 mM ethyleneglycoltetraacetic syre (EGTA), 250 mM saccharose, 2 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) og 10 µg ml−1 hvert af de protease-hæmmere leupeptin, pepstatin og aprotinin. Homogenatet blev holdt på is i 20 minutter og derefter centrifugeret ved 10.000 g g i 15 minutter og supernatanten blev anvendt til 10% SDS-side. Proteinkoncentrationerne blev målt af Brandford Kits.