crecimiento vegetal

semillas de tomate CM (Castlemart, tipo silvestre) fueron germinadas y cultivadas en una cámara de crecimiento bajo 18 h de luz a 27 °C y 6 h de oscuridad a 18 °C En cultivo hidropónico o sustrato. Se cosecharon plantas con hojas verdaderas expandidas saludables para la preparación de GCP (archivo adicional 1: Fig. S1 y Fig. 1)., Los fragmentos epidérmicos de hojas verdaderas fueron recolectados como se describe para el método L o método s.

Protector de las células en diferentes etapas de la digestión enzimática en el Método L (a–c) y Método S (d–l). a-f siete hojas completamente expandidas de las plantas hidropónicas seleccionadas para el aislamiento de GCP (archivo adicional 1: Fig. S1). g-I siete hojas completamente expandidas de las plantas de cultivo de sustrato seleccionadas para el aislamiento de GCP., j-l cuatro hojas completamente expandidas de las plantas hidropónicas (plantas más jóvenes en comparación con d–f) seleccionadas para el aislamiento de GCP. A, d, h, k el estado de GCs después de 1.5, 0.5, 2 y 0.5 h de digestión en solución enzimática 1. b, e el estado de GCs después de 2 y 1 h de digestión en solución enzimática 2. c, f, i, l el estado de GCs después de 3.5, 2.5, 4.5 y 1.5 h de digestión en solución enzimática 2. Las barras de escala indican 20 µm

preparación de GCP: método L

las hojas verdaderas completamente expandidas (pesadas ~ 10 g) se cosecharon de plantas de tomate hidropónicas., Luego, las hojas se mezclaron durante 1 min (tres pulsos de 20 s) en una licuadora (18,000 rpm/min) en 250 ml de agua destilada fría. La mezcla de hojas mezcladas se vertió a través de una malla de nylon de 74 µm para eliminar las células mesófilas rotas y se enjuagó varias veces con agua destilada fría hasta que la mayor parte de la espuma producida por la mezcla había desaparecido en gran medida y los fragmentos epidérmicos eran de color verde pálido. Luego, los tejidos epidérmicos se transfirieron a un matraz que contenía 50 ml de solución enzimática 1 que se incubó durante 1,5 h a 27 ° C En un baño de agua de agitación en la oscuridad, con la velocidad de agitación establecida en 100 rpm., Después de 1,5 h de incubación, los fragmentos epidérmicos se recogieron en una malla de nylon de 58 µm, se enjuagaron suavemente con medio básico 2 y se transfirieron a 50 ml de solución enzimática 2 en un matraz. Esta solución que contenía los fragmentos se incubó a 25 °C En un baño de agua de agitación (70 rpm) hasta que la mayoría de los GCP se liberaron, típicamente después de aproximadamente 3.5 h. para mejorar la liberación de GCP de las exfoliaciones epidérmicas, el matraz se agitó suavemente a mano durante unos segundos al final de la digestión., Además, las cáscaras de la solución enzimática se pasaron suavemente varias veces a través de un pipettor equipado con una punta de 5 ml que se cortó para liberar los GCP. El efecto enzimólisis se evaluó al microscopio. La segunda mezcla de digestión enzimática se filtró a través de una malla de nylon de 37 µm. Los tejidos epidérmicos en la malla se enjuagaron con medio básico 2 para liberar GCP. La solución enzimática que contenía los protoplastos se filtró a través de una malla de nylon de 15 µm, y los GCP liberados se recogieron (en tubos de centrífuga de 50 ml) por centrifugación durante 6 min a 300×g., Los GCP se lavaron tres veces con medio básico 2 para mantener los GCP libres del pellet de células mixtas y otros desechos. Después de retirar el sobrenadante, se obtuvo un volumen de 5 ml de protoplastos, que se almacenó a 4 °C En la oscuridad para la siguiente purificación o para otros experimentos.

preparación de GCP: Método s

este protocolo se derivó del «método L», con una modificación que involucró la composición de la solución enzimática 1. La solución enzimática 1 consiste en 1,0% (p/v) celulosa «Onozuka» RS, 0,01% (p/v) Pectoliasa y-23, 0,1% (p/v) PVP-40, 0,25% (p/v) albúmina sérica bovina y 0.,Ácido L-ascórbico de 5 mM, disuelto en medio básico 1. La mejora en el método S redujo el tiempo requerido en 2 h en comparación con el método L. La primera digestión enzimática necesita solo 0.5 h, mientras que la segunda digestión enzimática necesita 2.5 h y 1.5 h (con plantas jóvenes Fig. 1).

purificación de GCP

para eliminar fragmentos de tejido vascular y contaminantes de GCP, se realizó un paso de purificación adicional que mejora significativamente la pureza de los GCP., El protocolo de purificación de los GCP fue de acuerdo con el de los métodos anteriores , con modificaciones adaptadas para el tomate que se describen aquí. La solución básica 2 se añadió a la suspensión de GCP para dar un volumen final de 8 ml. Seis mililitros de Histopaco (No. 1077, Sigma-Aldrich) fueron cuidadosamente pipeteados en el fondo de un tubo de centrífuga. Los GCP se colocaron cuidadosamente encima del Histopaco. Los tubos se centrifugaron durante 20 min a 150 × g, después de lo cual los GCP se recogieron de la interfaz de las dos soluciones con una pipeta Pasteur y se transfirieron a un nuevo tubo de ensayo., Los GCP se diluyeron con la solución básica 2, y luego los tubos se centrifugaron durante 6 min a 300×g. se retiró el sobrenadante, y los GCP aislados se resuspendieron en 1 ml de solución básica 2 y se mantuvieron en hielo en la oscuridad hasta las pruebas posteriores.

evaluación de la viabilidad de los protoplastos

la viabilidad de los GCP se evaluó mediante mediciones de fluorescencia con diacetato de fluoresceína (FDA). La hidrólisis del tinte se observó después de mezclar GCP con la mezcla de incubación durante 5 min. La concentración operativa de la FDA fue de 0,01% (p/v) disuelta en acetona., Las preparaciones de protoplastos fueron vistas y fotografiadas usando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axio Observer D1 con excitación azul usando la combinación de filtros FITC.

preparación de MCPs

El método para aislar Solanum lycopersicum se modifica del descrito por Romano et al. . Las hojas completamente expandidas se cortan en piezas de 0,5 cm2. Las hojas se transfieren a 30 ml de solución enzimática: 5 mM Mes, 0.65 M d-manitol, 1 mM CaCl2, 0.5% (w: v) Macerozyme R-10 (Yakult, Japón), 1% (w: v) celulasa R-10 (Yakult, Japón), 0.25% (w: v) BSA y 0.1% (w: v) PVP-40, pH 5.5 (KOH)., La digestión se realiza a 25 °C durante 2 h con agitación lenta (40 excursiones por minuto) en un baño de agua. La solución enzimática se vuelve verde después de un suave movimiento de remolino, lo que indica la liberación de protoplastos. El tiempo de digestión depende de los objetivos experimentales y los materiales utilizados. No es necesario liberar todos los protoplastos de las hojas. La solución se filtra a través de una malla de nylon de 37 µm en un tubo centrífugo de 50 ml. Los trozos de hoja retenidos se enjuagan con 20 ml de medio de incubación (0,65 m d-manitol, 1 mM CaCl2) y también se recoge el filtrado., Los MCP liberados fueron recolectados por centrifugación durante 5 min a 100 × g. El pellet fue lavado tres veces con 0.65 m d-manitol conteniendo 1 mM CaCl2. Los MCP aislados se almacenaron en hielo en la oscuridad hasta su uso.

análisis PCR Semicuantitativos de transcripción inversa

el ARN Total se extrajo de GCP y protoplastos de células mesófilas (MCPs) utilizando el kit de aislamiento de ARN Arcturus PicoPure (Applied Biosystems, Cat no. 12204-01, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante., El ARN Total se transcribió inversamente en ADNc utilizando el sistema de síntesis de primera cadena Super-Script (TransGen Biotech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó RT-PCR semicuantitativa con dos genes que se expresaron específicamente en células guardas o células mesófilas para evaluar la pureza de los protoplastos. El gen de actina (forward primer, 5 ‘- CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′; reverse primer, 5′-TCACCAGAGTCCAACACAA TAC-3’) se utilizó como control para experimentos de RT-PCR., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (qRT-PCR)

el qRT-PCR se realizó con cuatro genes que se expresaban preferentemente en células guardas o se representaban como reguladores de la respuesta ABA y mostraban inducción o represión a nivel de transcripción en respuesta a MeJA en células guardas. Suspensión de GCP incubada en tubos de microfuga de 1,5 ml a temperatura ambiente durante 10 min, y luego tratada con 50 µM ± MeJA (concentración final) durante 5, 10, 15, 20 min. Después de la incubación, las células de guardia se recolectaron simultáneamente, se congelaron y se almacenaron a − 80 °C hasta un análisis posterior., Teniendo en cuenta que el protoplasting induce la expresión de genes asociados al estrés, se utilizaron dos inhibidores de la transcripción diferentes, actinomicina D (33 mg/L) y cordycepin (100 mg/L), en todos los procedimientos del aislamiento, incluido el primer paso de mezcla . Se realizaron los análisis qRT-PCR de la expresión temprana de los genes de respuesta de la herida con o sin los inhibidores de la transcripción.

el ARN Total se aisló de los GCP, utilizando el kit de aislamiento de ARN Arcturus PicoPure (Applied Biosystems, Cat no. 12204-01, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante., Todas las muestras de ARN fueron digeridas con DNasa libre de RNasa para extraer el ADN genómico. La calidad y concentración de cada una de las muestras de ARN se determinó utilizando el espectrofotómetro Namedrop 2000 (Thermo Scientific). La integridad del ARN también se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa. Para la PCR en tiempo real, el ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando el sistema de síntesis de primera cadena Super-Script (TransGen Biotech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante., El ADNc se utilizó como plantilla para realizar PCR en tiempo real con cebadores específicos de genes (archivo adicional 1: Tabla S1) y SYBR Green Mix (TaKaRa) en un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 TouchTM (Bio-Rad). El gen de actina se utilizó como normalización interna en las muestras. El cambio de pliegue en la expresión génica se calculó utilizando los valores de ΔΔCt.

extracción de proteínas y análisis SDS-PAGE

se prepararon fracciones proteicas solubles de hojas, MCPs y GCP según Li y Assmann . Todos los pasos posteriores se realizaron a 4 °C., Protoplastos y hojas en polvo mezclados con 40 µl de tampón frío en tubos de microfuga. El tampón fue de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM MgCl2, 2 mM ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,25 mM ácido etilenglicoltetraacético (EGTA), 250 mM sacarosa, 2 mM ditiotreitol (TDT), 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y 10 µg ml−1 cada uno de los inhibidores de la proteasa leupeptin, pepstatina y aprotinina. El homogeneizado se mantuvo en hielo durante 20 min y luego se centrifugó a 10.000 × g durante 15 min y el sobrenadante se utilizó para 10% SDS-PAGE. Las concentraciones de proteínas se midieron mediante los kits de Brandford.