Kasvien kasvua

tomaatin CM (Castlemart, wild type) olivat itäneet ja kasvaneet kasvu-jaosto alle 18 h valo 27 °C ja 6 h pimeä 18 °C hydroponics tai alustan kulttuuri. Kasvit, joilla on terveet laajennetut todelliset lehdet, korjattiin GCPs: n valmistamiseksi(lisätiedosto 1: kuva. S1 ja Fig. 1)., Epidermaalinen palasia totta lehdet kerättiin kuvattua Menetelmää L tai Menetelmä, S.

Vartija solujen eri vaiheissa entsymaattinen ruoansulatusta Menetelmä L (a–c) ja Menetelmä S (d–l). a–f Seitsemän täysin laajennettu lehdet hydroponic kasvit valittu GCPs eristäminen (Lisää tiedosto 1: Fig. S1). G-I seitsemän täysin laajennettu lehdet substraattiviljelmät kasvit valitaan GCPs eristäminen., j–l Neljä täysin laajennettu lehdet hydroponic kasvit (nuorempi kasveja verrattuna d–f) valittu GCPs eristäminen. a -, d -, h -, k-tilan GCs jälkeen 1.5, 0.5, 2 ja 0,5 h ruoansulatusta entsyymin ratkaisu 1. B, e GCs: n tila entsyymiliuoksessa 2 ja 1 tunnin digestion jälkeen 2. C, f, i, l GCs: n tila 3,5, 2,5, 4,5 ja 1,5 tunnin ruuansulatuksen jälkeen entsyymiliuoksessa 2. Asteikko palkit osoittavat 20 µm

Valmistelu GCPs: Menetelmä L

täysin laajennettu totta lehdet (punnittu ~ 10 g) oli korjattu hydroponic tomaatilla., Sitten lehdet sekoitettiin 1 min (kolme 20 S: n pulssia) tehosekoittimessa (18 000 rpm/min) 250 ml: aan kylmää tislattua vettä. Monimuoto-lehti seos kaadetaan läpi-74 µm nylon mesh poistaa rikki mesophyll soluja ja huuhdellaan useita kertoja kylmällä tislattua vettä, kunnes suurin osa vaahto tuotettu sekoittamalla oli pitkälti kadonnut ja epidermaalinen fragmentit olivat vaalean vihreät. Sitten, epidermaalinen kudosten siirrettiin osaksi pullo, jossa 50 ml entsyymin ratkaisu 1, joka oli inkuboitiin 1,5 h 27 °C ravistamalla vesi kylpy pimeässä, vapina nopeudella 100 rpm., Jälkeen 1,5 h inkuboinnin, epidermaalinen palasia kerättiin 58 µm nylon mesh, huuhdellaan varovasti perus medium 2 ja siirretään 50 ml: n entsyymin ratkaisu 2 pulloon. Tämä ratkaisu sisältää palasia oli sitten inkuboitiin 25 °C vesihauderavistin (70 min), kunnes suurin osa GCPs vapautettiin, tyypillisesti noin 3.5 h. Parantaa julkaisun GCPs alkaen orvaskeden kuorii, pullo oli pyöritellään varovasti kädessäsi muutaman sekunnin lopussa ruoansulatusta., Lisäksi kuoria entsyymin ratkaisu oli kevyesti kulunut useita kertoja läpi pipetti on varustettu 5 ml: n kärki, joka oli leikata vapauttaa GCPs. Entsymolyysivaikutus arvioitiin mikroskoopilla. Toinen entsyymin pilkkoutumisseos suodatettiin 37-µm nailonverkon läpi. Silmäkoossa olevat epidermaaliset kudokset huuhdeltiin perusväliaineella 2, jotta ne vapautuisivat edelleen. Entsyymin ratkaisu, joka sisältää protoplasts oli sitten suodatetaan 15 µm nylon mesh, ja julkaisi GCPs kerättiin (50 ml: n sentrifugiputkiin) sentrifugoimalla 6 min 300×g., Se GCPs pestiin kolme kertaa perus medium 2 pitää GCPs vapaa pelletti seka-solut ja muut roskat. Supernatantin poistamisen jälkeen saatiin 5 ml protoplasteja, joita säilytettiin 4 ° C: ssa pimeässä seuraavaa puhdistusta tai muita kokeita varten.

Valmistelu GCPs: Menetelmä S

Tämä pöytäkirja on johdettu Menetelmä ”L”, jossa yksi muutos, johon koostumus entsyymin ratkaisu 1. Entsyymi ratkaisu 1 koostuu 1.0% (w/v) selluloosa ”Onozuka” RS, 0.01% (w/v) Pectolyase Y-23, kuin 0,1% (w/v) PVP-40, 0.25% (w/v) naudan seerumin albumiinia ja 0.,5 mM L-askorbiinihappo, liuotettuna perusaineeseen 1. Parantamisen Menetelmä S vähentää aikaa, joka tarvitaan 2 h verrattuna Menetelmä L. ensimmäinen entsyymi ruoansulatusta tarvitsee vain 0,5 s, kun taas toinen entsyymi ruoansulatusta tarvitsee 2,5 h ja 1,5 h (nuorten kasveja Kuva. 1).

Puhdistus GCPs

irrota palasia ja verisuoni kudosten ja epäpuhtaudet GCPs, ylimääräinen puhdistus vaihe oli suoritettu, joka merkittävästi parantaa puhtaus GCPs., Puhdistus pöytäkirjan GCPs oli mukaan se, että edellisen menetelmiä , joilla muutokset sovitettu tomaatti kuvattu täällä. Perusratkaisu 2 lisättiin gcps-suspensioon, jotta lopullinen tilavuus olisi 8 ml. Kuusi millilitraa Histopaque (Nro 1077, Sigma-Aldrich) oli varovasti pipetillä pohjaan sentrifugiputkeen. GCPs oli sitten huolellisesti kerrostettu päälle Histopaque. Putket olivat sentrifugoidaan 20 min 150×g, jonka jälkeen GCPs kerättiin käyttöliittymä kaksi ratkaisuja Pasteur-pipetillä ja siirrettiin uuteen koeputkeen., Se GCPs olivat laimentaa perus ratkaisu 2, ja sitten putket sentrifugoidaan 6 min 300×g. Supernatantti poistettiin, ja eristetty GCPs olivat sekoitettava uudelleen 1 ml: n perus ratkaisu 2 ja pidetään jäällä pimeässä, kunnes myöhemmät testit.

Arviointi protoplastien elinkelpoisuuden

elinkelpoisuuden GCPs arvioitiin fluoresenssi mittaukset fluoreseiini-diasetaatti (FDA). Väriainehydrolyysi havaittiin, kun gcps oli sekoitettu inkubaatioseokseen 5 minuutin ajan. FDA: n käyttöpitoisuus oli 0,01% (w/v) liuotettuna asetoniin., Protoplastien valmistelut oli tarkastella ja kuvata käyttäen Zeiss Axio Observer D1 fluoresenssi mikroskooppi sininen heräte käyttäen FITC-suodatin yhdistelmä.

Valmistelu Mcp

tapa eristää Solanum lycopersicum on muokattu, että kuvattu Romano et al. . Täysin levennetyt lehdet leikataan 0,5 cm2 paloiksi. Lehtien palaset ovat sitten siirretään 30 ml entsyymin ratkaisu: 5 mM Mes, 0,65 M D-mannitoli, 1 mM CaCl2, oli 0,5% (w: v) Macerozyme R-10 (Yakult, Japani), 1% (w: v) Sellulaasi R-10 (Yakult, Japani), 0.25% (w: v) BSA: n ja 0,1% (w: v) PVP-40, pH 5.5 (KOH)., Ruoansulatus tapahtuu 25 °C: ssa 2 tunnin ajan hitaasti ravistamalla (40 kierrosta minuutissa) vesihauteessa. Entsyymiliuos muuttuu vihreäksi hellävaraisen pyörittelyliikkeen jälkeen, mikä viittaa protoplastien vapautumiseen. Ruoansulatusaika riippuu kokeellisista tavoitteista ja käytetyistä materiaaleista. Kaikkia protoplasteja ei tarvitse vapauttaa lehtien palasista. Liuos suodatetaan 37 µm nailonverkon läpi 50 ml: n sentrifugiputkeen. Lehtiä kappaletta säilytetään huuhdellaan 20 ml inkuboinnin medium (0,65 M D-mannitoli, 1 mM CaCl2) ja suodos kerätään myös., Julkaistu Mcp kerättiin sentrifugoimalla 5 min 100×g. Pelletti pestiin kolme kertaa 0,65 M D-mannitoli, jossa on 1 mM CaCl2. Eristetyt MCP: t varastoitiin jäihin pimeässä käyttöä varten.

Semi-quantitative reverse-transkriptio PCR-analyysit

Kokonais-RNA uutettiin GCPs ja mesophyll solun protoplasts (Mcp) käyttäen Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Cat no. 12204-01, USA) valmistajan mukaan on pöytäkirja., Total RNA oli reverse-kopioidaan cDNA käyttää Super-Käsikirjoituksen ensimmäinen strand synteesi järjestelmä (TransGen Biotech) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin kaksi geeniä, jotka olivat nimenomaisesti ilmaistu vartija soluja tai mesophyll solut arvioida protoplastien puhtaus. Aktiini-geenin (forward-aluke, 5′-CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′; reverse primer, 5′-TCACCAGAGTCCAACACAA TAC-3′) käytettiin kontrollina RT-PCR-kokeita., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

Kvantitatiivinen real-time PCR (qRT-PCR) analyysit

qRT-PCR suoritettiin neljä geeniä, jotka olivat ensisijaisesti ilmaistu vartija soluja tai kuvattu sääntelyviranomaisten ABA vastaus ja osoitti transkriptio tason induktio tai sorron vastauksena MeJA in vartija soluja. GCPs suspensiota inkuboitiin 1,5 ml mikrofugiputket huoneenlämpöön 10 min, ja sitten käsiteltiin 50 µM ± MeJA (lopullinen pitoisuus) 5, 10, 15, 20 min. Inkubaation jälkeen suojasoluja kerättiin samanaikaisesti, pakastettiin ja säilytettiin − 80 °C: ssa lisäanalyysiin asti., Ottaen huomioon, että protoplasting indusoi ilmaus stressi-liittyvät geenit, kaksi eri transkriptio-estäjät, aktinomysiini D (33 mg/L) ja cordycepin (100 mg/L), käytettiin kaikki menettelyt eristäminen, mukaan lukien ensimmäinen vaihe sekoittaminen . QRT-PCR-analyysit varhaisen haavan vasteen geenien ilmentymisestä transkription estäjien kanssa tai ilman niitä tehtiin.

Yhteensä RNA eristettiin GCPs, käyttäen Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Cat no. 12204-01, USA) valmistajan mukaan on pöytäkirja., Kaikki RNA-näytteet sulatettiin rnaasittomalla Dnaasilla genomisen DNA: n poistamiseksi. Laatu ja pitoisuus kunkin RNA-näytteet määritettiin käyttäen Namedrop 2000 spektrofotometrillä (Thermo Scientific). RNA: n eheyttä tarkastettiin myös agaroosigeelielektroforeesilla. Real-time PCR, kokonais-RNA oli reverse-kopioidaan cDNA käyttää Super-Käsikirjoituksen ensimmäinen strand synteesi järjestelmä (TransGen Biotech) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti., Sen ekspressio oli käytetty mallina suorittaa real-time PCR-gene-spesifisiä alukkeita (Lisää tiedosto 1: Taulukko S1) ja SYBR Green Mix (TaKaRa) vuonna CFX96 TouchTM Real-Time PCR detection system (Bio-Rad). Actin-geeniä käytettiin näytteiden sisäisenä normalisointina. Geeniekspression kertamuutos laskettiin ΔΔCt-arvojen avulla.

Proteiini louhinta-ja SDS-PAGE-analyysit

Liukoinen proteiini jakeet lehdet, Mcp ja GCPs olivat valmiita mukaan Li ja Assmann . Kaikki seuraavat vaiheet suoritettiin 4 °C: ssa., Protoplastit ja lehdet jauhe sekoitetaan 40 µl jääkylmää puskuria mikrofugiputkissa. Buffer 50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl2, 2 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), 0.25 mM ethyleneglycoltetraacetic happo (EGTA), 250 mM sakkaroosi, 2 mM ditiotreitolia (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoridi (PMSF) ja 10 µg ml−1 kukin proteaasin estäjät leupeptin, pepstatin ja aprotiniinia. Se homogenaattia pidettiin jäällä 20 min ja sentrifugoidaan 10 000 x g 15 min ja supernatantti käytettiin 10% SDS-PAGE. Proteiinipitoisuudet mitattiin Brandford Kitsin avulla.