növénynövekedés

paradicsom cm (Castlemart, vad típus) magjai csíráztak és termesztettek egy növekedési kamrában 18 h fény alatt 27 °C-on és 6 h sötét 18 °C-on hidroponikában vagy szubsztrátkultúrában. Az egészséges, kiterjesztett valódi levelekkel rendelkező növényeket gcps előkészítéséhez szüretelték (további 1. fájl: ábra. S1 és Fig. 1)., A valódi levelek epidermális töredékeit az L vagy az S.

Guard sejtek az enzimatikus emésztés különböző szakaszaiban az L (A–c) módszer és az S (d–l) módszer szerint. A-F hét teljesen kibővített levelek a hidroponikus növények kiválasztott gcps szigetelés (további fájl 1: ábra. S1). G-I hét teljesen kiterjesztett levelek a szubsztrát kultúra növények kiválasztott gcps izolálása., j-l négy teljesen kiterjesztett levelek a hidroponikus növények (fiatalabb növények képest d–f) kiválasztott gcps izolálás. a, d, h, k a GCS állapota 1,5, 0,5, 2 és 0,5 h emésztés után az enzimoldatban 1. b, E a GCS állapota 2 és 1 óra emésztés után a 2. enzimoldatban. c, f, i, l a GCS állapota 3,5, 2,5, 4,5 és 1,5 óra emésztés után a 2.enzimoldatban. A skála rudak 20 µm

Gcps előkészítése: l módszer

a teljesen kiterjesztett valódi leveleket (súlya ~ 10 g) hidroponikus paradicsomnövényekből szüretelték., Ezután a leveleket 1 percig (három 20 s impulzust) keverőben (18 000 fordulat/perc) keverték 250 ml hideg desztillált vízben. A kevert levél keveréket öntött keresztül 74-µm-nylon háló, hogy távolítsa el a törött mesophyll sejtek öblíteni többször hideg desztillált víz, míg a legtöbb a hab által termelt keverési volt, nagyrészt eltűnt, az epidermális töredékek voltak halvány zöld. Ezután az epidermális szöveteket 50 ml 1 enzimoldatot tartalmazó lombikba helyeztük át, amelyet 1,5 órán át inkubáltunk 27 °C-on rázóvízfürdőben sötétben, a rázási sebesség 100 fordulat / perc., Után 1,5 h inkubálás, epidermális töredékek gyűjtötték egy 58-µm-nylon háló, öblíteni óvatosan alapvető közepes 2, illetve át 50 ml enzim 2. megoldás egy lombikba. Ez a megoldás, amely a töredékek volt, akkor inkubálják 25 °C-rázta vízfürdő (70 rpm), míg a legtöbb GCPs is megjelent, jellemzően után körülbelül 3,5 óra. Javítja a kiadás GCPs a epidermális hámlani kezd, a lombik volt, kavargott óvatosan kézzel néhány másodpercig végén az emésztést., Ezenkívül az enzimoldatban lévő héjakat többször óvatosan átengedték egy 5 ml-es csúcsú pipettán keresztül,amelyet a GCPs felszabadítására vágtak. Az enzimolízis hatását mikroszkóp alatt értékelték. A második enzimemésztési keveréket 37 µm-es nylon hálón szűrtük. A hálón lévő epidermális szöveteket 2-es alapközeggel leöblítettük a GCPs további felszabadulása érdekében. A protoplasztokat tartalmazó enzimoldatot ezután egy 15 µm-es nejlonhálón szűrtük át, majd a felszabaduló GCP-ket (50 ml-es centrifugacsövekben) 6 percig centrifugálással gyűjtöttük össze 300×g-on., A GCP-ket háromszor megmossuk a basic medium 2-vel, hogy a GCP-k mentesek maradjanak a kevert sejtek és egyéb törmelékek pelletjétől. A felülúszó eltávolítása után 5 ml protoplaszt térfogatot kaptunk, amelyet 4 °C-on sötétben tároltunk a következő tisztításhoz vagy más kísérletekhez.

Gcps előkészítése: s módszer

Ez a protokoll az “L. módszerből” származik, egy módosítással, amely az 1 enzimoldat összetételét tartalmazza. Az 1.enzimoldat 1,0% (m/v) “Onozuka” RS cellulózból, 0,01% (m/v) y-23 Pektolázból, 0,1% (m/v) PVP-40-ből, 0,25% (m/v) szarvasmarha szérum albuminból és 0.,5 mM L-aszkorbinsav, bázikus közegben oldva 1. Az S módszer javulása 2 h-val csökkentette a szükséges időt az L. módszerhez képest.az első enzim emésztés csak 0,5 h-t igényel, míg a második enzim emésztése 2,5 h-t és 1,5 h-t igényel (fiatal növényekkel Fig. 1).

A gcps

tisztítása az érszövetek és szennyeződések gcps-ből való eltávolítására egy további tisztítási lépést végeztünk, amely jelentősen javítja a GCPs tisztaságát., A GCPs tisztítási protokollja a korábbi módszerek szerint történt, az itt leírt paradicsomhoz igazított módosításokkal. A gcps szuszpenzióhoz 2-es alapoldatot adtunk, hogy a végső térfogat 8 ml legyen. Hat milliliter Hisztopaque (no. 1077, Sigma-Aldrich) gondosan pipettázott egy centrifugacső aljára. A GCP-ket ezután óvatosan rétegezték a Hisztopaque tetejére. A csöveket 20 percig centrifugáltuk 150×g-on, majd a GCP-ket a két megoldás interfészéből Pasztőrös pipettával gyűjtöttük össze, majd egy új kémcsőbe helyeztük át., A GCPs volt hígított alapvető megoldás 2, majd a csöveket centrifugált 6 perc 300×g. A felülúszót eltávolítottuk, majd az izolált GCPs volt újraszuszpendált 1 ml alapvető megoldás 2 jegelni a sötétben, amíg későbbi vizsgálatok.

a protoplaszt életképességének értékelése

a GCP-K életképességét fluoreszcens diacetáttal (FDA) végzett fluoreszcencia mérésekkel értékelték. A festék hidrolízisét figyelték meg, miután a gcps-t 5 percig összekeverték az inkubációs keverékkel. Az FDA működési koncentrációja 0,01% (w/v) volt acetonban oldva., A protoplaszt készítményeket egy Zeiss Axio Observer D1 fluoreszcens mikroszkóp segítségével, kék gerjesztéssel, FITC szűrő kombinációval néztük meg és utánoztuk.

MCPs

a Solanum lycopersicum izolálására szolgáló módszert a Romano et al. . A teljesen kibővített leveleket 0,5 cm-re vágják2 darab. A levéldarabokat ezután 30 ml enzimoldatra helyezzük át: 5 mM Mes, 0,65 M D-mannit, 1 mM CaCl2, 0,5% (w: V) Macerozyme R-10 (Yakult, Japán), 1% (w: v) celluláz R-10 (Yakult, Japán), 0,25% (w: v) BSA és 0,1% (w: v) PVP-40, pH 5,5 (KOH)., Az emésztést 25 °C-on végezzük 2 órán keresztül lassú rázással (40 kirándulás percenként) vízfürdőben. Az enzimoldat enyhe kavargó mozgás után zöldre vált, jelezve a protoplasztok felszabadulását. Az emésztési idő a kísérleti céloktól és a felhasznált anyagoktól függ. Nem szükséges az összes protoplasztot felszabadítani a levéldarabokból. Az oldatot 37 µm-es nylon hálón szűrjük egy 50 ml-es centrifugacsőbe. A megmaradt levéldarabokat 20 ml inkubációs közeggel (0,65 M D-mannit, 1 mM CaCl2) öblítjük, és a szűrletet is összegyűjtjük., A felszabadult MCP-ket centrifugálással gyűjtöttük össze 5 percig 100×g-on, a pelletet háromszor mossuk 0,65 M D-mannitollal, amely 1 mM CaCl2-t tartalmaz. Az izolált MCP-ket jégen tárolták a sötétben használatig.

félig kvantitatív reverz transzkripciós PCR analízis

az összes RNS-t Gcps-ből és mezofillsejt protoplasztokból (MCPs) extrahálták Arcturus PicoPure RNS izolációs készlet (Applied Biosystems, Cat no. 12204-01, USA) alkalmazásával, a gyártó protokollja szerint., A teljes RNS-t a gyártó utasításai szerint a szuper-Script első szálú szintézis rendszer (TransGen Biotech) segítségével fordítottuk át cDNA-ra. A félig kvantitatív RT-PCR-t két génnel végezték, amelyeket kifejezetten védősejtekben vagy mezofill sejtekben fejeztek ki a protoplaszt tisztaságának felmérése érdekében. Az aktin gént (forward primer, 5′-CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′; reverse primer, 5′-TCACCAGAGTCCAACAA TAC-3′) az RT-PCR kísérletek kontrolljaként használták., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

Mennyiségi real-time PCR (qRT-PCR) elemzések

A qRT-PCR végeztek, a négy gének voltak kedvezményesen kifejezve őr sejtek vagy ábrázolták, mint szabályozók ABA válasz mutatott transcript szinten indukciós vagy elnyomásra válaszul MeJA az őr sejtek. A gcps szuszpenziót 1,5 ml-es mikrogömbös csövekben inkubáljuk szobahőmérsékleten 10 percig, majd 50 µM ± meja-val (végső koncentráció) kezeljük 5, 10, 15, 20 percig. Az inkubálás után a védősejteket egyszerre gyűjtötték össze, fagyasztották és − 80 °C-on tárolták a további elemzésig., Figyelembe véve, hogy a protoplasting a stresszel összefüggő gének expresszióját indukálja, két különböző transzkripciós inhibitort, az aktinomicin D-T (33 mg/L) és a cordycepint (100 mg/L) alkalmaztak az izolálás minden eljárásában, beleértve a keverés első lépését is . A korai sebreakciós gének expressziójának QRT-PCR analízisét transzkripciós inhibitorokkal vagy anélkül végezték el.

az összes RNS-t izoláltuk a GCPs-ből, az Arcturus PicoPure RNS izolációs készlet (Applied Biosystems, Cat no.12204-01, USA) segítségével a gyártó protokollja szerint., Az összes RNS-mintát RNáz-mentes Dnázzal emésztettük fel, hogy eltávolítsuk a genomikus DNS-t. Az egyes RNS-minták minőségét és koncentrációját Namedrop 2000 spektrofotométer (Thermo Scientific) segítségével határoztuk meg. Az RNS integritását agaróz gél elektroforézissel is ellenőriztük. A valós idejű PCR esetében a teljes RNS-t a gyártó utasításai szerint a szuper-Script első szálú szintézis rendszer (Trangen Biotech) segítségével fordították át cDNA-ra., A cDNA-t sablonként használták arra, hogy valós idejű PCR-t hajtsanak végre génspecifikus primerekkel (1.kiegészítő fájl: S1 táblázat) és SYBR Green Mix (TaKaRa) egy CFX96 TouchTM valós idejű PCR detektáló rendszerben (Bio-Rad). Az aktin gént belső normalizációként használták a mintákban. A génexpresszió Fold változását ΔΔCt értékek alapján számítottuk ki.

Protein extraction and SDS – Page analyses

a levelek, az MCP-k és a GCP-K oldható fehérjefrakcióit li és Assmann szerint állították elő . Minden további lépést 4 °C-on végeztünk., Protoplasztok és levelek por, 40 µl jéghideg pufferrel keverve, mikroszűrő csövekben. A puffer volt, 50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl2, 2 mM ethylenediaminetetraacetic sav (EDTA), 0.25 mM ethyleneglycoltetraacetic sav (EGTA), 250 mM, szacharóz -, 2 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF), valamint a 10 µg ml−1 minden a proteáz inhibitorok leupeptin, pepstatin, valamint aprotinin. A homogenizátumot 20 percig jégen tartották, majd 15 percig 10 000×g sebességgel centrifugálták, a felülúszót pedig 10% SDS-PAGE-hez használták. A fehérje koncentrációját a Brandford készletek mérték.