la crescita delle Piante

Semi di pomodoro CM (Castlemart, wild type) sono germinati e cresciuto in una camera di crescita al di sotto dei 18 ore di luce al 27 °C e 6 ore di buio alla temperatura di 18 °C in idroponica o substrato di cultura. Le piante con foglie vere espanse sane sono state raccolte per la preparazione di GCP (file aggiuntivo 1: Fig. S1 e Fig. 1)., I frammenti epidermici delle foglie vere sono stati raccolti come descritto per il metodo L o il metodo S.

Protegge le cellule in diversi stadi della digestione enzimatica nel Metodo L (a–c) e nel metodo S (d–l). a-f Sette foglie completamente espanse delle piante idroponiche selezionate per l’isolamento GCPs (File aggiuntivo 1: Fig. S1). g-i Sette foglie completamente espanse delle piante di coltura del substrato selezionate per l’isolamento GCP., j – l Quattro foglie completamente espanse delle piante idroponiche (piante più giovani rispetto a d–f) selezionate per l’isolamento GCPs. a, d, h, k Lo stato di GCs dopo 1,5, 0,5, 2 e 0,5 h di digestione in soluzione enzimatica 1. b, e Lo stato di GCs dopo 2 e 1 h di digestione in soluzione enzimatica 2. c, f, i, l Lo stato di GCs dopo 3.5, 2.5, 4.5 e 1.5 h di digestione in soluzione enzimatica 2. Le barre della scala indicano 20 µm

Preparazione di GCP: Metodo L

Le foglie vere completamente espanse (pesate ~ 10 g) sono state raccolte da piante di pomodoro idroponiche., Quindi, le foglie sono state mescolate per 1 min (tre impulsi di 20 s) in un frullatore (18.000 rpm/min) in 250 ml di acqua distillata fredda. La miscela di foglie miscelate è stata versata attraverso una rete di nylon 74-µm per rimuovere le cellule mesofille rotte e risciacquata più volte con acqua distillata fredda fino a quando la maggior parte della schiuma prodotta dalla miscelazione era in gran parte scomparsa e i frammenti epidermici erano di colore verde pallido. Quindi, i tessuti epidermici sono stati trasferiti in un pallone contenente 50 ml di soluzione enzimatica 1 che è stato incubato per 1,5 h a 27 °C in un bagno d’acqua tremante al buio, con la velocità di scuotimento impostata su 100 rpm., Dopo 1,5 ore di incubazione, i frammenti epidermici sono stati raccolti su una rete di nylon da 58 µm, risciacquati delicatamente con il mezzo base 2 e trasferiti in 50 ml di soluzione enzimatica 2 in un pallone. Questa soluzione contenente i frammenti è stata quindi incubata a 25 ° C in un bagno d’acqua tremante (70 rpm) fino a quando la maggior parte dei GCP sono stati rilasciati, in genere dopo circa 3,5 h. Per migliorare il rilascio di GCP dalle bucce epidermiche, il pallone è stato roteato delicatamente a mano per alcuni secondi alla fine della digestione., Inoltre, le bucce nella soluzione enzimatica sono state passate delicatamente più volte attraverso un pipettatore dotato di una punta da 5 ml che è stata tagliata per rilasciare i GCP. L’effetto dell’enzimolisi è stato valutato al microscopio. La seconda miscela di digestione enzimatica è stata filtrata attraverso una rete di nylon da 37 µm. I tessuti epidermici sulla rete sono stati risciacquati con basic medium 2 per rilasciare ulteriormente GCP. La soluzione enzimatica contenente i protoplasti è stata quindi filtrata attraverso una rete di nylon da 15 µm e i GCP rilasciati sono stati raccolti (in provette da centrifuga da 50 ml) mediante centrifugazione per 6 min a 300×g., I GCP sono stati lavati tre volte con basic medium 2 per mantenere i GCP liberi dal pellet di cellule miste e altri detriti. Dopo aver rimosso il surnatante, è stato prodotto un volume di 5 ml di protoplasti, che è stato conservato a 4 ° C al buio per la successiva purificazione o per altri esperimenti.

Preparazione di GCP: Metodo S

Questo protocollo è stato derivato dal “Metodo L”, con una modifica che coinvolge la composizione della soluzione enzimatica 1. La soluzione enzimatica 1 è costituita da 1,0% (p/v) cellulosa “Onozuka” RS, 0,01% (p/v) Pectolyase Y-23, 0,1% (p/v) PVP-40, 0,25% (p/v) albumina sierica bovina e 0.,Acido L-ascorbico 5 mm, disciolto in mezzo basico 1. Il miglioramento del Metodo S ha ridotto il tempo richiesto di 2 h rispetto al metodo L. La prima digestione enzimatica richiede solo 0,5 h, mentre la seconda digestione enzimatica richiede 2,5 h e 1,5 h (con piante giovani Fig. 1).

Purificazione di GCP

Per rimuovere frammenti di tessuto vascolare e contaminanti da GCP, è stata eseguita un’ulteriore fase di purificazione che migliora significativamente la purezza del GCP., Il protocollo di purificazione del GCP era conforme a quello dei metodi precedenti, con modifiche adattate per il pomodoro qui descritte. La soluzione base 2 è stata aggiunta alla sospensione GCPs per ottenere un volume finale di 8 ml. Sei millilitri di istopaco (n.1077, Sigma-Aldrich) sono stati accuratamente pipettati sul fondo di una provetta da centrifuga. I GCP sono stati quindi accuratamente stratificati sopra l’Istopaco. I tubi sono stati centrifugati per 20 min a 150×g, dopo di che i GCP sono stati raccolti dall’interfaccia delle due soluzioni con una pipetta Pasteur e trasferiti in una nuova provetta., I GCP sono stati diluiti con soluzione basica 2, quindi i tubi sono stati centrifugati per 6 min a 300×g. Il surnatante è stato rimosso e i GCP isolati sono stati risospesi in 1 ml di soluzione basica 2 e tenuti sul ghiaccio al buio fino a test successivi.

Valutazione della vitalità dei protoplasti

La vitalità dei GCP è stata valutata mediante misure di fluorescenza con fluoresceina diacetato (FDA). L’idrolisi del colorante è stata osservata dopo aver mescolato GCP con la miscela di incubazione per 5 min. La concentrazione operativa di FDA era 0.01% (w/v) disciolto in acetone., I preparati di protoplasti sono stati osservati e fotografati utilizzando un microscopio a fluorescenza Zeiss Axio Observer D1 con eccitazione blu utilizzando la combinazione di filtri FITC.

Preparazione di MCPs

Il metodo per isolare il Solanum lycopersicum è modificato da quello descritto da Romano et al. . Le foglie completamente espanse vengono tagliate in pezzi di 0,5 cm2. I pezzi fogliari vengono quindi trasferiti in 30 ml di soluzione enzimatica: 5 mm Mes, 0,65 M D-mannitolo, 1 mM CaCl2, 0,5% (w: v) Macerozima R-10 (Yakult, Giappone), 1% (w: v) Cellulasi R-10 (Yakult, Giappone), 0,25% (w: v) BSA e 0,1% (w: v) PVP-40, pH 5,5 (KOH)., La digestione viene eseguita a 25 °C per 2 h con agitazione lenta (40 escursioni al min) a bagnomaria. La soluzione enzimatica diventa verde dopo un delicato movimento vorticoso, indicando il rilascio di protoplasti. Il tempo di digestione dipende dagli obiettivi sperimentali e dai materiali utilizzati. Non è necessario rilasciare tutti i protoplasti dai pezzi fogliari. La soluzione viene filtrata attraverso una rete di nylon da 37 µm in una provetta da centrifuga da 50 ml. I pezzi di foglia trattenuti vengono risciacquati con 20 ml di mezzo di incubazione (0,65 M D-mannitolo, 1 mm CaCl2) e viene raccolto anche il filtrato., I MCP rilasciati sono stati raccolti mediante centrifugazione per 5 min a 100×g. Il pellet è stato lavato tre volte con 0,65 M D-mannitolo contenente 1 mm CaCl2. MCP isolati sono stati conservati sul ghiaccio al buio fino all’uso.

Analisi semi-quantitative di PCR a trascrizione inversa

L’RNA totale è stato estratto dai GCP e dai protoplasti delle cellule mesofille (MCP) utilizzando il kit di isolamento Arcturus PicoPure RNA (Applied Biosystems, Cat no. 12204-01, USA) secondo il protocollo del produttore., L’RNA totale è stato trascritto in cDNA utilizzando il sistema di sintesi del primo filamento Super-Script (TransGen Biotech) secondo le istruzioni del produttore. La RT-PCR semi-quantitativa è stata eseguita con due geni che sono stati specificamente espressi in cellule di guardia o cellule mesofille per valutare la purezza del protoplasto. Il gene dell’actina (forward primer, 5′-CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′; reverse primer, 5′-TCACCAGAGTCCAACACAA TAC-3′) è stato utilizzato come controllo per esperimenti RT-PCR., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

Analisi quantitative real-time PCR (qRT-PCR)

La qRT-PCR è stata eseguita con quattro geni che sono stati espressi preferenzialmente nelle cellule di guardia o rappresentati come regolatori della risposta ABA e hanno mostrato induzione o repressione a livello di trascrizione in risposta a MeJA nelle cellule di guardia. Sospensione GCPs incubata in provette per microfughe da 1,5 ml a temperatura ambiente per 10 min e poi trattata con 50 µM ± MeJA (concentrazione finale) per 5, 10, 15, 20 min. Dopo l’incubazione, le cellule di guardia sono state raccolte simultaneamente, congelate e conservate a − 80 °C fino a ulteriori analisi., Considerando che il protoplasting induce l’espressione dei geni sforzo-associati, due inibitori differenti della trascrizione, actinomycin D (33 mg/L) e cordycepin (100 mg/L), sono stati usati in tutte le procedure dell’isolamento, compreso il primo punto di miscelazione . Sono state eseguite le analisi qRT-PCR dell’espressione genica di risposta alla ferita precoce con o senza gli inibitori della trascrizione.

L’RNA totale è stato isolato dal GCP, utilizzando Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Cat no. 12204-01, USA) secondo il protocollo del produttore., Tutti i campioni di RNA sono stati digeriti con DNasi priva di RNasi per rimuovere il DNA genomico. La qualità e la concentrazione di ciascuno dei campioni di RNA sono state determinate utilizzando lo spettrofotometro Namedrop 2000 (Thermo Scientific). L’integrità dell’RNA è stata controllata anche mediante elettroforesi su gel di agarosio. Per la PCR in tempo reale, l’RNA totale è stato trascritto in cDNA utilizzando il Super-Script first-strand synthesis system (TransGen Biotech) secondo le istruzioni del produttore., Il cDNA è stato utilizzato come modello per eseguire PCR in tempo reale con primer specifici del gene (file aggiuntivo 1: Tabella S1) e SYBR Green Mix (TaKaRa) in un sistema di rilevamento PCR in tempo reale CFX96 TouchTM (Bio-Rad). Il gene dell’actina è stato usato come normalizzazione interna nei campioni. Il cambiamento di piega nell’espressione genica è stato calcolato utilizzando i valori ΔΔCt.

Estrazione di proteine e analisi SDS-PAGE

Le frazioni proteiche solubili di foglie, MCPs e GCP sono state preparate secondo Li e Assmann . Tutti i passaggi successivi sono stati eseguiti a 4 °C., Protoplasti e foglie in polvere miscelati con 40 µl di tampone ghiacciato in provette per microfughe. Il tampone era di 50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 1 mm MgCl2, 2 mm acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,25 mM acido etileneglicoltetraacetico (EGTA), 250 mm saccarosio, 2 mM ditiotreitolo (DTT), 1 mm fenilmetilsolfonil fluoruro (PMSF) e 10 µg ml−1 ciascuno degli inibitori della proteasi leupeptin, pepstatina e aprotinina. L’omogenato è stato tenuto sul ghiaccio per 20 minuti e poi centrifugato a 10.000×g per 15 minuti e il surnatante è stato utilizzato per il 10% SDS-PAGE. Le concentrazioni proteiche sono state misurate dai kit Brandford.