식 성장

씨앗의 토마토 CM(Castlemart,야생형)었 발아고 성장에 성장 챔버 18 서의 빛 에서 27°C,6 서의 어둠 속에서 18°C 에서는 수경법 또는 기판의 문화. 건강한 확장 된 진실한 잎을 가진 식물은 GCPs 의 준비를 위해 수확되었다(추가 파일 1:Fig. S1 및도. 1)., 표피의 조각 진정한 잎었으로 수집에 대해 설명한 방법 L 또는 방법 S.

방법 L(a–c)및 방법 S(d–l)에서 효소 소화의 상이한 단계에서의 가드 세포. A-f gcps 격리를 위해 선택된 수경 식물의 7 개의 완전히 확장 된 잎(추가 파일 1:Fig. S1). g-I Gcps 격리를 위해 선택된 기질 배양 식물의 7 개의 완전히 확장 된 잎., j-l GCPs 격리를 위해 선택된 수경 식물(d–f 와 비교하여 더 어린 식물)의 4 개의 완전히 확장 된 잎. a,d,h,k 효소 용액 1 에서 1.5,0.5,2 및 0.5h 의 소화 후 GCs 의 상태. b,e 효소 용액 2 에서 소화 2 및 1h 후 GCs 의 상태. c,f,i,l 효소 용액 2 에서 3.5,2.5,4.5 및 1.5h 의 소화 후 GCs 의 상태. 규모는 막대기를 표 20µm

의 준비 Gcp:방법 L

이 완전히 확장되는 진정한 나뭇잎(무게~10g)수확에서 토마토 수경 식물입니다., 이어서,물기를 차가운 증류수 250ml 에 블렌더(18,000rpm/min)에서 1 분(20s 의 3 펄스)동안 블렌딩하였다. 혼합 잎 혼합물을 붓고를 통해 74-μm 나일론 메시 제거 깨 mesophyll 세포를 씻을 여러 번과 감기 증류된 물을 때까지 대부분의 거품이 생산된 혼합하여했다 대부분 사라졌고 표피각했다 옅은 녹색입니다. 그런 다음,표 조직되었으로 전송하는 플라스크 50ml 효소의 솔루션 1 는 동안 배양 1.5h27°C 에서 흔들어 물에 목욕,어둠 속으로 흔들어 속도 설정되 100rpm., 후 1.5h 의 배양,표 조각에서 수집되었습니다 58-μm 나일론 메시,세척으로 부드럽게 기본적인 중간 2 전송로 50ml 효소의 솔루션에서 2flask. 이 솔루션을 포함하는 조각에는 다음이었 incubated25°C 에서 흔들어 물 bath(70rpm)까지의 대부분 Gcp,발표했는 일반적으로 약 후 3.5h. 을 개선하 릴리스의 Gcp 에서 상피 껍질,플라스크었 소용돌이 가볍게 손으로 몇 초 동안의 끝에서 소화입니다., 또한,효소 용액 내의 껍질을 gcps 를 방출하기 위해 절단 된 5-ml 팁이 장착 된 피펫 터를 통해 여러 번 부드럽게 통과시켰다. 효소 분해 효과는 현미경으로 평가되었다. 제 2 효소 소화 혼합물을 37-μm 나일론 메쉬를 통해 여과 하였다. 메쉬상의 표피 조직을 염기성 배지 2 로 헹구어 GCPs 를 추가로 방출 하였다. 이 효소는 솔루션을 포함하는 protoplasts 었다 그런 다음 필터링을 통해로 15μm 나일론 메시고,발표 Gcp 수집되었(50ml 튜브)원심분리하여 6 분에서 300×g., GCPs 를 기본 배지 2 로 3 회 세척하여 gcps 를 혼합 세포 및 기타 파편의 펠렛으로부터 자유롭게 유지시켰다. 를 제거한 후 상등액을 볼륨의 5ml protoplasts 었 나왔고,어느 저장되었 4°C 에서 어둠 속에서 다음 정화 또는 다른 실험을 합니다.

Gcps 의 제조:방법 S

이 프로토콜은 효소 용액 1 의 조성을 포함하는 하나의 변형과 함께”방법 L”로부터 유도되었다. 효소액 1 로 구성되어 있 1.0%(w/v)셀룰로오스”Onozuka”RS,0.01%(w/v)Pectolyase Y23,0.1%(w/v)PVP-40,0.25%(w/v)소 serum albumin0.,5mm L-아스 코르 빈산,염기성 배지 1 에 용해. 의 개선 방법 S 감소에서 필요한 시간을 2 시간과 비교 방법 L. 처음 효소 소화 요구를 만 0.5h 는 반면,두 번째는 효소 소화 필요 2.5h1.5h(으로 젊은 식물 Fig. 1).

정화 Gcp

제거하는 조각의 혈관 조직 및 오염 물질 Gcp,추가적인 정화 단계를 수행하는 크게 개선의 순도 Gcp., GCPs 의 정제 프로토콜은 여기에 설명 된 토마토에 맞게 수정 된 이전 방법의 프로토콜에 따라 이루어졌습니다. 염기성 용액 2 를 gcps 현탁액에 첨가하여 8ml 의 최종 부피를 수득 하였다. 6 밀리리터의 조직 불 투과성(No.1077,Sigma-Aldrich)을 원심 분리기 튜브의 바닥에 조심스럽게 피펫 팅했다. 그런 다음 Gcps 를 조직 불 투과성 위에 조심스럽게 계층화했습니다. 튜브를 150×g 에서 20 분 동안 원심 분리하고,그 후 GCPs 를 파스퇴르 피펫으로 두 용액의 계면에서 수집하고 새로운 시험관으로 옮겼다., Gcp 었으로 희석 기본적인 솔루션을 2,그리고 다음 튜브를 원심 분리하여 6 분에서 300×g. 상등액을 제거되었고,절연 Gcp 었 resuspended 에 1㎖를 기본적인 솔루션 2 및 보관에서는 얼음 때까지 어둠 속에서 후속 테스트합니다.

protoplast 생존력의 평가

gcps 의 생존력은 fluorescein diacetate(FDA)를 사용한 형광 측정에 의해 평가되었다. 염료 가수 분해는 5 분 동안 배양 혼합물과 GCPs 를 혼합 한 후에 관찰되었다. FDA 의 작동 농도는 아세톤에 용해 된 0.01%(w/v)였다., Fitc 필터 조합을 사용하여 청색 여기를 갖는 Zeiss Axio Observer D1 형광 현미경을 사용하여 원형질체 제제를보고 이미지화 하였다.

MCPs 의 제조

Solanum lycopersicum 을 분리시키는 방법은 Romano et al.에 의해 기술된 것으로부터 변형된다. . 완전히 확장 된 잎은 0.5cm2 조각으로 절단됩니다. 리프 작품은 그 다음에 전송 30ml 의 효소결책:5mM Mes,0.65M D-만니톨,1mM CaCl2,0.5%(w:v)Macerozyme R-10(야쿠르트,일본),1%(w:v)셀룰라아제 R-10(야쿠르트,일본),0.25%(w:v)BSA0.1%(w:v)PVP-40,pH5.5(코)., 소화는 물 목욕에서 느린 흔들림(분당 40 회)으로 2 시간 동안 25°c 에서 수행됩니다. 효소 용액은 부드러운 소용돌이 운동 후에 녹색으로 변하여 원형질체의 방출을 나타냅니다. 소화 시간은 사용 된 실험 목표와 재료에 따라 다릅니다. 잎 조각에서 모든 원형질체를 방출 할 필요는 없습니다. 용액을 37μm 나일론 메쉬를 통해 50-ml 원심 분리기 튜브로 여과한다. 유지된 잎 조각을 20ml 의 배양 배지(0.65M D-만니톨,1mM CaCl2)로 헹구고,여액도 수집한다., 방출 된 MCPs 를 100×g 에서 5 분 동안 원심 분리하여 수집하였고,펠렛을 1mM CaCl2 를 함유하는 0.65M D-만니톨로 3 회 세척 하였다. 격리 된 MCPs 는 사용할 때까지 어둠 속에서 얼음 위에 보관되었습니다.

Semi-quantitative 역 전사 PCR 분석

총 RNA 에서 추출되었 Gcp 및 mesophyll 셀 protoplasts(Mcp)사용하여 악튜러스 PicoPure RNA Isolation Kit(Applied Biosystems,고양이 아니다. 12204-01,미국)에 따르면 제조업체의 프로토콜입니다., Total RNA 는 제조사의 지침에 따라 Super-Script first-strand synthesis system(TransGen Biotech)을 사용하여 cDNA 로 역전사되었다. 반 정량적 RT-PCR 은 원형질체 순도를 평가하기 위해 가드 세포 또는 중배엽 세포에서 특이 적으로 발현 된 두 개의 유전자로 수행되었다. 액틴 유전자(전방 프라이머,5′-CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′;역 프라이머,5′-TCACCAGAGTCCAACACAA TAC-3′)를 RT-PCR 실험을위한 대조군으로 사용 하였다., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)분석

qRT-PCR 을 수행하였으로 네 개의 유전자는 우선적으로 표현에서 가드 셀 또는 묘사로 레귤레이터의 ABA 응답을 보여준 성적 수준의 유도 또는 억제에 대응하여 MeJA in guard cells. GCPs 현탁액을 실온에서 1.5ml 마이크로 퓨지 튜브에서 10 분 동안 배양 한 다음 5,10,15,20 분 동안 50μm±MeJA(최종 농도)로 처리 하였다. 배양 후,가드 세포를 동시에 수집하고,동결시키고,추가 분석까지−80℃에서 저장 하였다., 을 고려하는 protoplasting 의 표현을 유도 하는 스트레스 관련 유전자,두 개의 서로 다른 녹 억제제,마이신 D(33mg/L)및 cordycepin(100mg/L),에 사용 된 모든 절차의 격리를 포함하여,첫 번째 단계의 혼합이다. 전사 억제제의 유무에 관계없이 초기 상처-반응 유전자 발현의 qRT-PCR 분석을 수행 하였다.

총 RNA 는 제조사의 프로토콜에 따라 Arcturus PicoPure RNA 격리 키트(Applied Biosystems,CAT no.12204-01,USA)를 사용하여 GCPs 로부터 분리되었다., 모든 RNA 샘플을 게놈 DNA 를 제거하기 위해 RNase 가없는 DNase 로 소화시켰다. 각각의 rna 샘플의 품질과 농도는 Namedrop2000 분광 광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 결정되었습니다. Rna 의 완전성은 또한 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 검사되었다. 실시간 PCR 의 경우,total RNA 는 제조업체의 지침에 따라 Super-Script first-strand synthesis system(TransGen Biotech)을 사용하여 cDNA 로 역전사되었다., The cDNA 었으로 사용 템플릿을 수행하는 실시간 PCR 과 유전자는 특정 프라이머(추가 파일 1:테이블 S1)sybr 그린 혼합(TaKaRa)에 CFX96TouchTM 실시간 PCR 탐지 시스템(Bio-Rad). 액틴 유전자는 샘플에서 내부 정규화로 사용되었습니다. 유전자 발현의 폴드 변화는 ΔΔCt 값을 사용하여 계산되었다.

단백질 추출 및 SDS-PAGE 분석

잎,MCPs 및 GCPs 의 가용성 단백질 분획을 Li 및 Assmann 에 따라 제조 하였다. 모든 후속 단계는 4℃에서 수행되었다., Microfuge 관에 있는 얼음 찬 완충기의 40μl 와 섞인 Protoplasts 와 잎 분말. 버퍼되었는 50mm Tris–HCl,pH7.5,1mM 는 mgcl2,2mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA),0.25mM ethyleneglycoltetraacetic acid(EGTA),자당 250mM,2mM 됩(DTT),1mM phenylmethylsulfonyl 불(PMSF)및 10µg ml−1 의 각 단백질 분해효소 억제제 leupeptin,pepstatin 고 아프로 티닌. 균질산염을 20 분 동안 얼음 위에 유지시킨 다음 15 분 동안 10,000×g 에서 원심 분리하고 상청액을 10%SDS-PAGE 에 사용 하였다. 단백질 농도는 Brandford Kits 에 의해 측정되었습니다.피>