o crescimento da Planta

Sementes de tomate CM (Castlemart, tipo selvagem) foram germinadas e cultivadas em câmara de crescimento, menores de 18 h de luz, a 27 °C e 6 h de escuro à temperatura de 18 °C em hidroponia ou substrato de cultura. Plantas com folhas verdadeiras expandidas e saudáveis foram colhidas para preparação de GCP (arquivo adicional 1: Fig. S1 e Fig. 1)., Os fragmentos epidérmicos das folhas verdadeiras foram recolhidos de acordo com o método L ou o Método S.

guarda de células em diferentes fases de digestão enzimática no método L (A–C) e no método S (d–l). A-f Seven fully expanded leaves of the hydroponic plants selected for GCPs isolation (Additional file 1: Fig. S1). G-I sete folhas totalmente expandidas das plantas de cultura de substrato selecionadas para isolamento GCPs., j – L quatro folhas totalmente expandidas das plantas hidropônicas (plantas mais jovens em comparação com d–f) selecionadas para isolamento GCPs. A, d, h, k o estado do GCs após 1,5, 0,5, 2 e 0,5 h de digestão na solução enzimática 1. b, e o estado do GCs após 2 e 1 h de digestão na solução enzimática 2. C, f, I, L O Estado dos GCs após 3.5, 2.5, 4.5 e 1.5 h de digestão na solução enzimática 2. As barras de escala indicam 20 µm

preparação de GCP: método L

as folhas verdadeiras completamente expandidas (pesadas ~ 10 g) foram colhidas em tomateiras hidropónicas., Em seguida, as folhas foram misturadas durante 1 min (três pulsos de 20 s) num misturador (18.000 rpm/min) em 250 ml de água destilada a frio. A mistura de folhas misturadas foi vertida através de uma malha de nylon de 74 µm para remover células mesofilas partidas e lavada várias vezes com água destilada a frio até que a maior parte da espuma produzida pela mistura tinha desaparecido em grande parte e os fragmentos epidérmicos eram verdes pálidos. Em seguida, transferiram-se os tecidos epidérmicos para um frasco contendo 50 ml de solução enzimática 1, que foi incubado durante 1,5 h a 27 °C num banho de água agitando na escuridão, com a velocidade de agitação fixada em 100 rpm., Após 1, 5 h de incubação, os fragmentos epidérmicos foram recolhidos numa malha de nylon de 58 µm, enxaguados suavemente com o meio básico 2 e transferidos para 50 ml de solução enzimática 2 num balão. Esta solução contendo os fragmentos foi, em seguida, incubados a 25 °C em um tremendo banho de água (70 rpm) até que a maioria das Bpcs foram lançados, normalmente após cerca de 3,5 h. Para melhorar a liberação do Bpcs da epiderme das cascas, o frasco foi agitado suavemente a mão por alguns segundos, no final da digestão., Além disso, as cascas da solução enzimática foram suavemente passadas várias vezes através de um pipettor equipado com uma ponta de 5 ml que foi cortada para libertar o GCP. O efeito enzimólise foi avaliado ao microscópio. A segunda mistura de digestão enzimática foi filtrada através de malha de nylon de 37 µm. Os tecidos epidérmicos na malha foram enxaguados com meio básico 2 para posterior libertação de GCP. A solução enzimática contendo os protoplastos foi então filtrada através de uma malha de nylon de 15 µm, e os GCP libertados foram recolhidos (em tubos de centrifugação de 50 ml) por centrifugação durante 6 minutos a 300×g., O GCPs foi lavado três vezes com o meio básico 2 para manter o GCPs livre do sedimento de células mistas e outros detritos. Após remoção do sobrenadante, foi produzido um volume de 5 ml de protoplastos, que foi armazenado a 4 °C no escuro para a próxima purificação ou para outras experiências.

preparação de GCP: método S

Este protocolo foi derivado do” método L”, com uma modificação envolvendo a composição da solução enzimática 1. A solução enzimática 1 consiste em 1, 0% (M/v) de celulose “Onozuka” RS, 0, 01% (M/v) de Pectoliase Y-23, 0, 1% (M/v) de PVP-40, 0, 25% (M/v) de albumina sérica bovina e 0.,Ácido L-ascórbico de 5 mM, dissolvido no meio básico 1. A melhoria do método S reduziu o tempo necessário em 2 h em comparação com o método L. A primeira Digestão Enzimática necessita apenas de 0,5 h, enquanto a segunda Digestão Enzimática necessita de 2,5 h e 1,5 h (com os figos das plantas jovens. 1).purificação de GCP

Para remover fragmentos de tecido vascular e contaminantes de GCP, foi realizada uma etapa de purificação adicional que melhora significativamente a pureza do GCP., O protocolo de purificação do GCP foi de acordo com o dos métodos anteriores , com modificações adaptadas para o tomate descrito aqui. A solução básica 2 foi adicionada à suspensão GCPs para obter um volume final de 8 ml. Seis mililitros de Histopaque (No. 1077, Sigma-Aldrich) foram cuidadosamente pipetados para o fundo de um tubo de centrifugação. O GCPs foi então cuidadosamente colocado em camadas no topo da Histopaca. Os tubos foram centrifugados durante 20 minutos a 150 × g, após o que os GCP foram recolhidos da interface das duas soluções com uma pipeta Pasteur e transferidos para um novo tubo de ensaio., O GCP foi diluído com a solução de Base 2 e os tubos foram centrifugados durante 6 minutos a 300×g. o sobrenadante foi removido e os GCP isolados foram ressuspendidos em 1 ml de solução de Base 2 e mantidos em gelo no escuro até ensaios subsequentes. a viabilidade do GCPs foi avaliada através de medições de fluorescência com diacetato de fluoresceína (FDA). A hidrólise do corante foi observada após misturar GCP com a mistura de incubação durante 5 minutos. A concentração operacional da FDA foi de 0, 01% (M/v) dissolvida em acetona., As preparações de protoplastos foram visualizadas e fotografadas utilizando um microscópio fluorescente D1 Observer de Zeiss Axio com excitação azul usando a combinação de filtro FITC.o método de isolamento de Solanum lycopersicum é modificado a partir do descrito por Romano et al. . As folhas totalmente expandidas são cortadas em 0,5 cm2. A folha peças são então transferidos para 30 ml de solução enzimática: 5 mM Mes, 0,65 M D-manitol, 1 mM de CaCl2, de 0,5% (m: v) Macerozyme R-10 (Yakult, Japão), 1% (m: v) Celulase R-10 (Yakult, Japão), de 0,25% (m: v) BSA e 0,1% (m: v) PVP-40, pH 5,5 (KOH)., A digestão é realizada a 25 °C durante 2 h, com agitação lenta (40 excursões por minuto) num banho-maria. A solução enzimática torna-se Verde após movimentos suaves de rotação, indicando a libertação de protoplastos. O tempo de digestão depende dos objetivos experimentais e dos materiais utilizados. Não é necessário libertar todos os protoplastos das folhas. A solução é filtrada através de uma malha de nylon de 37 µm num tubo de centrifugação de 50 ml. Enxaguam-se as folhas retidas com 20 ml de meio de incubação (0,65 M D-manitol, 1 mM CaCl2) e recolhe-se também o filtrado., Os MCP libertados foram recolhidos por centrifugação durante 5 minutos a 100 × g. o sedimento foi lavado três vezes com 0,65 M D-manitol contendo 1 mM CaCl2. Os MCP isolados foram armazenados no gelo no escuro até serem utilizados.

análises Semi-quantitativas de transcrição reversa de PCR

o RNA Total foi extraído de protoplastos de células GCP e mesofíll (CMP) usando o Kit de isolamento de ARN de Picopure Arcturus (Applied Biosystems, Cat n. o 12204-01, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante., O RNA Total foi transcrito para o cDNA usando o Super-Script first-strand synthesis system (TransGen Biotech) de acordo com as instruções do fabricante. A RT-PCR semi-quantitativa foi realizada com dois genes que foram especificamente expressos em células de guarda ou células mesofilas para avaliar a pureza dos protoplastos. O gene da actina (primer dianteiro, 5′-CCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′; primer reverso, 5′-TCACCAGTCCAACAA TAC-3′) foi utilizado como controlo para experiências RT-PCR., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

PCR Quantitativo em tempo real (anual-PCR) análises

O trim-PCR foi realizada com quatro genes que foram preferencialmente expressos em células guarda ou retratado como reguladores da ABA de resposta e mostrou transcrição nível de indução ou repressão em resposta a MeJA na guarda de células. Suspensão GCPs incubada em tubos de microfuge de 1, 5 ml à temperatura ambiente durante 10 minutos, e depois tratada com 50 µM ± MeJA (concentração final) durante 5, 10, 15, 20 min. Após a incubação, as células de protecção foram recolhidas simultaneamente, congeladas e armazenadas a − 80 °C até uma análise mais aprofundada., Considerando que o protoplasting induz a expressão de genes associados ao stress, dois inibidores de transcrição diferentes, actinomicina D (33 mg/L) e cordicepina (100 mg/L), foram utilizados em todos os procedimentos de isolamento, incluindo o primeiro passo de mistura . Foram realizadas as análises qRT-PCR da expressão precoce dos genes de resposta à ferida, com ou sem os inibidores de transcrição.

RNA Total foi isolado a partir do GCPs, usando Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Cat n. º 12204-01, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. , Todas as amostras de ARN foram digeridas com DNase livre para remover o ADN genómico. A qualidade e concentração de cada uma das amostras de RNA foi determinada usando espectrofotômetro de Nomerop 2000 (termo científico). A integridade do ARN foi também verificada pela electroforese em gel de agarose. Para PCR em tempo real, o RNA total foi transcrito para cDNA usando o Super-Script first-strand synthesis system (TransGen Biotech) de acordo com as instruções do fabricante., O cDNA foi usado como um modelo para executar PCR em tempo real com primers específicos de genes (arquivo adicional 1: Tabela S1) e SYBR Green Mix (TaKaRa) em um CFX96 TouchTM sistema de detecção PCR em tempo Real (Bio-Rad). O gene da actina foi usado como uma normalização interna em amostras. A alteração de dobra na expressão do gene foi calculada utilizando valores ΔΔCt.as fracções proteicas solúveis das folhas, dos CIM e dos GCP foram preparadas de acordo com Li e Assmann . Todas as etapas subsequentes foram realizadas a 4 ° C., Pó de protoplastos e folhas misturado com 40 µl de tampão gelado em tubos de microfuge. O tampão 50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 1 mM de MgCl2, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0,25 mM ethyleneglycoltetraacetic ácido (EGTA), sacarose 250 mM, 2 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoreto (PMSF) e 10 µg ml−1 de cada um dos inibidores de protease leupeptin, pepstatin e aprotinin. O homogeneizado foi mantido em gelo durante 20 minutos e depois centrifugado a 10 000×g durante 15 minutos, tendo o sobrenadante sido utilizado durante 10% da página SDS. As concentrações de proteínas foram medidas pelos Kits de Brandford.