replicarea exactă a genomului este esențială pentru viabilitatea oricărui organism. Conceptul general de copiere a ADN-ului a fost evident prin elucidarea structurii dublu elicoidale a ADN-ului și identificarea complementarității perechilor de baze (1): un fir de nucleobaze ar putea servi drept șablon pentru sinteza unui nou fir. În decurs de un deceniu de la aceste descoperiri, un agent a fost purificat din E. coli care a catalizat duplicarea ADN-ului (2). Acest agent a fost numit „polimerază”. E., coli ADN polimeraza I, prima ADN polimerază descoperită nu a fost polimeraza replicativă primară, ci una implicată în rezolvarea fragmentului Okazaki și repararea ADN-ului. Acest lucru a prefigurat descoperirile viitoare ale multor familii de polimeraze ADN, fiecare servind cerințe celulare specifice pentru replicarea și repararea ADN-ului.ADN polimerazele servesc ca enzime fundamentale în științele vieții din același motiv pentru care sunt de natură critică: copiază ADN-ul. Aplicațiile polimerazei includ etichetarea ADN, secvențierea și amplificarea., O anumită amplificare protocol, reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică utilizată pe scară largă, care are termofile polimeraze pentru a amplifica exponențial anumite segmente de ADN (3) și permite o gamă largă de aplicații de la om și patogen diagnosticare pentru clonarea moleculara în laboratoare de biologie din întreaga lume.

Polimeraza Precizie

PCR pune aceleași cerințe de bază pe o polimeraza ca o celulă pune pe sistem de replicare. În esență, polimeraza trebuie să fie fiabilă, precisă și rapidă., Precizia polimerazei sau” fidelitatea ” se referă la tendința de a încorpora nucleotida corectă, așa cum este specificată de componenta șablon. Enzimele PCR standard nu sunt, în mod surprinzător, destul de precise. Chiar și polimeraza ADN Thermus aquaticus (Taq), considerată o polimerază PCR cu fidelitate scăzută, face o greșeală o singură dată în aproximativ inserții de nucleotide (12)., Descoperirea polimerazei și eforturile de inginerie au produs polimeraze de înaltă fidelitate, care rareori fac greșeli de substituție a bazei, necesitând metode de secvențiere a ADN-ului pentru a citi milioane de baze sintetizate pentru a detecta orice erori prin progresele polimerazei în măsurarea fidelității prin secvențierea cu o singură moleculă a identificat Q5® polimeraza ADN de înaltă fidelitate ca având o fidelitate de 280x,

puncte de verificare a fidelității: selecția geometrică la locul activ și dincolo de

ADN polimerazele asigură replicarea exactă folosind o serie de puncte de control moleculare, la locul încorporării nucleotidelor și dincolo de (1). În timpul adaosului de nucleotide, nucleotida de intrare corectă este poziționată pentru o aliniere productivă a grupărilor catalitice, asigurând încorporarea eficientă. Această aliniere pentru cataliză este sensibilă la distorsiuni în poziție cauzate de asocierea incorectă a bazei Watson-Crick, permițând blocarea cinetică la perechi de baze incorecte sau non-înrudite., o altă metodă de creștere a fidelității este ca polimeraza să aibă activitate exonuclează 3→5, denumită „corectură”. Folosind punctele de control moleculare de bază și situsul activ descrise mai sus, ADN polimeraza Taq este incredibil de precisă, dar enzimele de corectare pot avea o fidelitate și mai mare. Această precizie suplimentară este transmisă prin corectură, polimeraza „verificând” dacă nucleotida corectă a fost introdusă în șablon., Dacă se detectează o nepotrivire, ADN-ul este transferat din domeniul de polimerizare într-un domeniu de exonuclează n-terminal 3→5 al polimerazei. Nucleotida încorporată incorect este excizată, ADN-ul se deplasează înapoi în domeniul polimerizării, iar copierea poate fi reluată (Figura 2).

Bacteriofag T4 s-a dovedit a fi util un sistem experimental pentru evaluarea importanței 3→5 exonuclease activitate precisă replicarea ADN-ului (6). Au fost identificate mutații ale genei T4 43 (care codifică ADN polimeraza) care fie au scăzut, fie au crescut fidelitatea. Prin definirea unui raport de activitate exonuclează/polimerază (N/P) pentru o enzimă mutantă sa constatat că polimerazele cu raporturi n/P scăzute au fost mai predispuse la erori decât cele cu raporturi n / P ridicate., O explicație pentru această observație este că, la încorporarea unei baze nepotrivite, este mai probabil ca exonuclează nucleotida înainte ca activitatea polimerazei să o extindă în enzime cu raporturi n/P mai mari. Interesant este că eficacitatea corectării unei polimeraze poate arăta dependența secvenței. De exemplu, secvențele AT-rich sunt corectate mai eficient decât regiunile GC. Se consideră că această discrepanță se datorează stabilității mai scăzute a regiunilor AT care facilitează topirea firelor și, prin urmare, activitatea de corectare.,

absența activității exonucleazei 3→5 poate avea alte ramificații decât fidelitatea în PCR. Lipsa activității de corectură în ADN polimeraza Taq a fost propusă pentru a limita dimensiunea ampliconului posibilă cu această enzimă (7). În general, Taq funcționează cel mai bine atunci când amplifică fragmente de ADN < 2 kb și poate funcționa cu fragmente de până la 3-4 kb. Când este păstrat la această dimensiune amplicon, Taq este o enzimă robustă, ușor optimizată. Cu toate acestea, peste ~3 kb scade rapid în eficacitate., În timpul PCR, Taq va incorpora nucleotidele și va produce neconcordanțe, la care este predispus la blocare și este mai probabil să se disocieze înainte de a se extinde în comparație cu baza corectă pereche 3 capete. Prin urmare, la o anumită dimensiune amplicon și rata de eroare a polimerazei suficient de nepotrivite 3 capete pot acumula pentru a inhiba în mod eficient procesul PCR. Aceste capete 3 nepotrivite sunt deosebit de problematice pentru Taq, deoarece îi lipsește activitatea de exonuclează 3→5 pentru a le elimina., Prin adăugarea unei cantități mici de enzimă de corectare, cum ar fi ADN polimeraza Deep Vent®, se poate obține amplificarea fragmentelor ≥ 20 kb (Figura 3). Deoarece marea majoritate a enzimei din amestec este ADN polimeraza Taq, probabil că face cea mai mare parte a extensiei primerului, cu polimeraza de aerisire profundă care corectează eliminarea nepotrivirilor inhibitoare 3 generate de Taq.,

Polimeraza Processivity

importanța corectură activitate a PCR a fost cunoscut de aproape două decenii, dar o altă proprietate, processivity, a câștigat o atenție sporită., „Procesivitate” este un termen care se referă la numărul de nucleotide încorporate de o polimerază într-un singur eveniment de legare (înainte de disociere). ADN polimeraza Taq adaugă aproximativ 50 de nucleotide per eveniment de legare (8). De ce contează asta? O polimerază cu procesivitate scăzută sau „distributivă” extinde o populație de șabloane într-o manieră vizibil diferită de o polimerază procesivă. O polimerază foarte distributivă se leagă de un șablon, adaugă câteva nucleotide și disociază, lăsând o populație de șabloane care pot fi extinse în mod egal cu timpul., O polimerază foarte procesivă leagă un șablon și se extinde cu evenimente de legare mai lungi.

ar urma ca, dat suficient timp rezultatul fie o reacție de polimerază procesivă sau distributivă ar fi o populație de șabloane copiate. Cu toate acestea, în anumite circumstanțe este posibil ca polimeraza procesivă să aibă performanțe superioare. E. coli polimeraza III α subunitate, o parte din principalele osteoblasti polimeraza, are o processivity de < 10 perechi de bază și o viteză de < 20 nucleotide/secundă (nt/s)., Cu toate acestea, atunci când subunitatea asociații cu alte replisome subunități, în special clema de alunecare, eficienta processivity și replicare viteza de creștere la > 50 kb și 1.000 nt/s, respectiv (9). Termenul de „eficient processivity” este folosit pentru că nu există date care indică polimeraza subunitate poate schimb în replisome, dar replisome menține repede, processive replicarea ADN-ului (10). pentru a profita de procesivitate în PCR, cercetătorii au fuzionat un domeniu de legare ADN la o polimerază arhaeală (11)., Acest himeric enzimă are mai multe proprietăți îmbunătățite, dar în special este capabil de a amplifica ADN-ul cu extindere mai scurtă ori și produce mai ADN produse mai eficient, scurtând astfel de ansamblu termociclu ori. Această idee de fuziune este baza ADN polimerazei de înaltă fidelitate Q5 și a ADN polimerazei de înaltă fidelitate Phusion®, două polimeraze disponibile de la NEB (Figura 4).

Direcții Viitoare

Multe proprietăți afecta eficacitatea și utilitatea unui PCR reacția de polimerizare. Arhitectura sitului activ al polimerazei și activitatea de corectare afectează precizia produsului final. Amestecurile de polimerază și fuziunea cu o proteină de legare a ADN conferă performanțe PCR superioare pentru lungimea ampliconului și, în cazul chimerei, viteza de reacție., Alte progrese importante în PCR, cum ar fi polimerazele cu pornire la cald pentru creșterea specificității reacției, multiplex PCR (Figura 5) și qPCR au revoluționat, de asemenea, științele vieții.

așa cum s-a demonstrat prin amestecurile și himerele proiectate, proprietățile polimerazei în sine pot fi modulate pentru a îmbunătăți performanța PCR. În viitor, este probabil ca proprietățile polimerazei să fie adaptate din ce în ce mai mult la aplicații PCR specifice și, ca atare, acesta este un domeniu important de cercetare la NEB.,

Vizualizați diagrama de selecție a ADN polimerazei NEB