multe aplicații biologice, cum ar fi microbiologia, cultura celulară, activitatea sângelui și multe altele care utilizează celule necesită determinarea concentrației celulare pentru experimentul nostru.

Celulă de numărare este destul de simplă și necesită o cameră de numărare a sunat un hemocytometer, un dispozitiv inventat de al 19-lea anatomistul francez Louis-Charles Malassez pentru a efectua numărul de celule sanguine. Un hemocitometru constă dintr-o lamelă de microscop din sticlă groasă, cu o grilă de linii perpendiculare gravate în mijloc., Grila a specificat dimensiunile astfel încât zona acoperită de linii să fie cunoscută, ceea ce face posibilă numărarea numărului de celule într-un volum specific de soluție.

Figura 1. Un Clasic Hemocytometer

Cel mai comun tip de hemocytometer are un „H” forma gravate în mijloc, care cuprinde două oglindă lustruit grila de suprafețe și oferă acoperire alunecare zona de montaj (Figura 1).,

Încărcarea hemocytometer

Înainte de a începe a se asigura că atât hemocytometer și lamelă de acoperire sunt curat prin eliminarea oricăror particule de praf cu lentile de hârtie. Capacele care sunt utilizate pentru montarea pe hemocitometre sunt făcute special pentru a fi mai groase decât capacele convenționale de microscopie, deoarece trebuie să poată depăși tensiunea superficială a unei picături de lichid.

asigurați-vă că așezați mai întâi capacul peste suprafața de numărare înainte de a încărca suspensia celulei., Apoi puneți vârful pipetei împreună cu proba dvs. într-unul din puțurile în formă de V, ca în Figura 2, și expulzați ușor proba. Zona de sub acoperire se umple prin acțiune capilară. Trebuie introdus suficient lichid, astfel încât suprafața oglindită să fie acoperită, de obicei în jur de 10 µl, dar să nu supraîncărcați suprafața. Puteți încărca două probe pe un hemocitometru, unul în fiecare dintre cele două grile.

Figura 2., Încărcarea Hemocitometrului

hemocitometrul încărcat este apoi plasat pe scena microscopului, iar grila de numărare este adusă în centrul atenției la putere redusă. Permiteți eșantionului să se așeze pentru câteva minute și evitați deplasarea lamei de acoperire, deoarece ar putea introduce bule de aer și ar putea îngreuna numărarea.

numărarea celulelor într-un hemocitometru

grila completă de pe un hemocitometru conține nouă pătrate, fiecare dintre acestea fiind de 1 mm2 (Figura 3). Zona centrală de numărare a hemocitometrului (figura 3b) conține 25 de pătrate mari și fiecare pătrat mare are 16 pătrate mai mici., Când numărați, numărați numai acele celule pe liniile celor două laturi ale pătratului mare pentru a evita numărarea celulelor de două ori (figura 3G). Suspensiile trebuie diluate suficient, astfel încât celulele sau alte particule să nu se suprapună între ele pe grilă și să fie distribuite uniform.

Figura 3. Numărarea celulelor pe Hemocitometru.pentru a distinge între celulele moarte și cele viabile, proba este adesea diluată cu o anumită pată, cum ar fi albastrul Trypan., Această metodă de colorare, cunoscută și sub denumirea de colorare de excludere a colorantului, folosește un colorant diazo care pătrunde selectiv în membranele celulare ale celulelor moarte, colorându-le albastru, în timp ce nu este absorbit de membranele celulelor vii, excluzând astfel celulele vii de la colorare. Atunci când este privit sub un microscop, celulele moarte ar apărea ca albastru închis (Figura 4)

Figura 4. Trypan excluderea albastră a celulelor vii pe Hemocitometru. (Săgeata indică absorbția colorantului prin membrana celulelor moarte.,pentru a efectua numărătoarea, determinați mărirea necesară pentru a recunoaște tipul de celulă dorit și numărați sistematic celulele în pătrate selectate, astfel încât numărul total să fie de aproximativ 100 de celule, un număr minim de celule necesare pentru un număr semnificativ statistic.pentru celulele mari, puteți număra pur și simplu celulele din interiorul celor patru pătrate mari de colț (figura 3C-F) și cea din mijloc (figura 3b). Pentru o suspensie densă de celule mici, ați putea dori să numărați celulele din cele patru pătrate exterioare și mijlocii ale pătratului central (figura 3b) sau să faceți o suspensie mai diluată.,

amintiți-vă dacă o celulă se suprapune unei hotărâri, numărați-o ca „in” dacă se suprapune Hotărârii de sus sau de dreapta și „out” dacă se suprapune Hotărârii de jos sau de stânga (figura 3G).

zona de mijloc (Figura 3B) și fiecare colț de pătrat (Figura 3C-F) este de 1 mm x 1 mm = 1 mm2: adâncimea de fiecare pătrat este de 0,1 mm. Volumul final al fiecărui pătrat la care adâncimea este de 100nl.,

Odată ce au obținut, în total numărul de celule, celule de concentrare poate fi calculată din următoarea formulă:

Deci, de exemplu, dacă ați diluat proba 1:1 cu Trypan blue, și ai numărat 325 celule în 4 pătrate de colț plus central pătrat mare, total de celule pe ml =

Dacă vrei să știi cât de multe celule aveți în proba originală, multiplica doar de celula concentrare pe total volumul de probă. De exemplu, dacă volumul inițial al eșantionului este de 5 ml, atunci eșantionul dvs. are un total =