secvențierea generației următoare

Introducere

secvențierea genomului uman a fost finalizată în 2003, după 13 ani de colaborare internațională și investiții de 3 miliarde USD. Proiectul genomului uman a folosit secvențierea Sanger( deși puternic optimizată), principala metodă de secvențiere a ADN-ului de la inventarea sa în anii 1970.

astăzi, cererea de secvențiere crește exponențial, cu cantități mari de ADN genomic care trebuie analizate rapid, ieftin și precis., Datorită noilor tehnologii de secvențiere cunoscute colectiv ca secvențiere de generație următoare, acum este posibilă secvențierea unui întreg genom uman în câteva ore.

secvențierea Sanger și secvențierea generației următoare

principiul din spatele secvențierii generației următoare (NGS) este similar cu cel al secvențierii Sanger, care se bazează pe electroforeza capilară. Catena genomică este fragmentată, iar bazele din fiecare fragment sunt identificate prin semnale emise atunci când fragmentele sunt legate de un fir șablon.,
metoda Sanger a necesitat pași separați pentru secvențiere, separare (prin electroforeză) și detectare, ceea ce a făcut dificilă automatizarea pregătirii probei și a fost limitată în ceea ce privește debitul, scalabilitatea și rezoluția. Metoda NGS folosește secvențierea bazată pe matrice, care combină tehnicile dezvoltate în secvențierea Sanger pentru a procesa milioane de reacții în paralel, rezultând o viteză foarte mare și un randament la un cost redus., Proiectele de secvențiere a genomului care au durat mulți ani cu metodele Sanger pot fi acum finalizate în ore cu NGS, deși cu lungimi de citire mai scurte (numărul de baze care sunt secvențiate la un moment dat) și mai puțină precizie.,

Următoarea generație de metode de secvențiere a ADN-ului au, în general, trei etape:

• Biblioteca preparare: biblioteci sunt create folosind aleatoriu de fragmentare a ADN-ului, urmată de ligatura cu custom linkeri
• Amplificare: biblioteca este amplificat cu ajutorul clonală metode de amplificare PCR și
• Secvențiere: ADN-ul este ordonate, folosind una dintre mai multe abordări diferite

Biblioteca de pregătire

în Primul rând, ADN-ul este fragmentat, fie enzimatic sau prin sonicare (excitație folosind ultrasunete) pentru a crea șuvițe mici., Adaptorii (bucăți scurte, dublu-catenare de ADN sintetic) sunt apoi ligați la aceste fragmente cu ajutorul ligazei ADN, o enzimă care unește firele ADN. Adaptoarele permit secvenței să devină legată de o contrapartidă complementară.

adaptorii sunt sintetizați astfel încât un capăt să fie „lipicios”, în timp ce celălalt este „contondent” (necoeziv) în vederea îmbinării capătului contondent cu ADN-ul cu capăt contondent. Acest lucru ar putea duce la problema potențială a împerecherii de bază între molecule și, prin urmare, formarea dimerilor., Pentru a preveni acest lucru, se utilizează structura chimică a ADN-ului, deoarece ligarea are loc între capetele 3′-OH și 5′ – P. Prin îndepărtarea fosfatului de la capătul lipicios al adaptorului și, prin urmare, prin crearea unui capăt de 5′-OH, ligaza ADN nu poate forma o punte între cei doi termini (Figura 1).,

pentru secvențiere a fi de succes, biblioteca fragmentele trebuie să fie grupate spațial în PCR colonii sau ‘polonies’ deoarece acestea sunt în mod convențional cunoscut, care constau din mai multe exemplare dintr-un anumit biblioteca fragment. Deoarece aceste polonii sunt atașate într-un mod planar, caracteristicile matricei pot fi manipulate enzimatic în paralel. Această metodă de construcție a bibliotecii este mult mai rapidă decât procedura anterioară de muncă intensivă de culegere a coloniilor și E., clonarea coli utilizată pentru a izola și amplifica ADN-ul pentru secvențierea Sanger, cu toate acestea, aceasta este în detrimentul lungimii citite a fragmentelor.

amplificare

amplificarea bibliotecii este necesară pentru ca semnalul recepționat de la secvențiator să fie suficient de puternic pentru a fi detectat cu precizie. Cu amplificarea enzimatică, pot apărea fenomene precum „biasing” și „duplicarea”, ceea ce duce la amplificarea preferențială a anumitor fragmente de bibliotecă. În schimb, există mai multe tipuri de proces de amplificare care utilizează PCR pentru a crea un număr mare de clustere ADN.,

emulsie PCR

uleiul de emulsie, granulele, amestecul PCR și ADN-ul de bibliotecă sunt amestecate pentru a forma o emulsie care duce la formarea de micro godeuri (Figura 2).

În ordinea de succesiune a fi de succes, fiecare micro bine ar trebui să conțină un șirag de mărgele cu o catenă de ADN (aproximativ 15% din micro wells sunt din această compoziție). PCR denaturează apoi fragmentul bibliotecii care conduce două fire separate, dintre care unul (firul invers) se întoarce la talon., ADN-ul recopt este amplificat de polimerază pornind de la talon spre locul de grund. Firul invers original denaturează apoi și este eliberat din talon doar pentru a re-recoacere la talon pentru a da două fire separate. Acestea sunt ambele amplificate pentru a da două fire de ADN atașate la talon. Procesul este apoi repetat peste 30-60 de cicluri care conduc la clustere de ADN. Această tehnică a fost criticată pentru natura sa consumatoare de timp, deoarece necesită mai multe etape (formarea și ruperea emulsiei, amplificarea PCR, îmbogățirea etc.), în ciuda utilizării sale extinse în multe dintre platformele NGS., De asemenea, este relativ ineficient, deoarece doar aproximativ două treimi din micro reactoare emulsie va conține de fapt un șirag de mărgele. Prin urmare, este necesar un pas suplimentar pentru a separa sistemele goale care duc la mai multe inexactități potențiale.

Bridge PCR

suprafața celulei de flux este acoperită dens cu primeri care sunt complementari primerilor atașați fragmentelor de bibliotecă ADN (Figura 3). ADN-ul este apoi atașat la suprafața celulei la întâmplare, unde este expus la reactivi pentru extensia pe bază de polimerază., La adăugarea de nucleotide și enzime, capetele libere ale firelor unice ale ADN-ului se atașează la suprafața celulei prin primeri complementari, creând structuri cu punte. Enzimele interacționează apoi cu punțile pentru a le face dublu catenar, astfel încât atunci când are loc denaturarea, două fragmente de ADN cu un singur catenar sunt atașate la suprafață în imediata apropiere. Repetarea acestui proces duce la clustere clonale de catene identice localizate. Pentru a optimiza densitatea clusterului, concentrațiile de reactivi trebuie monitorizate foarte atent pentru a evita supraaglomerarea.,

Secvențiere

mai Multe concurente metode de Secventiere de noua Generatie au fost dezvoltate de diferite companii.

454 Pirosequencing

Pirosequencing se bazează pe principiul „secvențierii prin sinteză”, în care un fir complementar este sintetizat în prezența enzimei polimerazei (Figura 4). În contrast cu utilizarea dideoxynucleotides pentru a termina lanțul de amplificare (ca în secvențiere Sanger), pyrosequencing în loc detectează eliberarea de pirofosfat când nucleotide sunt adăugate în lanțul ADN., Se utilizează inițial tehnica PCR emulsie pentru a construi poloniile necesare pentru secvențiere și elimină componenta complementară. Apoi, o ssDNA secvențiere grund hybridizes la capătul firului (grund-regiune de legare), apoi patru diferite dNTPs sunt apoi secvențial făcut să curgă în și din fântâni de-a lungul polonies. Când dNTP-ul corect este încorporat enzimatic în catenă, provoacă eliberarea de pirofosfat. În prezența ATP sulfurilazei și adenozinei, pirofosfatul este transformat în ATP., Această moleculă ATP este utilizată pentru Conversia catalizată de luciferină în oxiluciferină, care produce lumină care poate fi detectată cu o cameră foto. Intensitatea relativă a luminii este proporțională cu cantitatea de bază adăugată (adică un vârf de două ori intensitatea indică faptul că două baze identice au fost adăugate succesiv).,

Pyrosequencing, dezvoltat de 454 Life Sciences, a fost unul dintre primele succese de Next-generation sequencing; într-adevăr, 454 Life Sciences a produs primul disponibil comercial de ultimă generație sequencer. Cu toate acestea, metoda a fost eclipsată de alte tehnologii și, în 2013, noii proprietari Roche au anunțat închiderea 454 Life Sciences și întreruperea platformei 454 pyrosequencing.,secvențierea Ion torrent semiconductor

secvențierea Ion torrent utilizează o abordare „secvențiere prin sinteză”, în care o nouă catenă ADN, complementară cu catena țintă, este sintetizată o bază la un moment dat. Un cip semiconductor detectează ionii de hidrogen produși în timpul polimerizării ADN (Figura 5).

după formarea Poloniei folosind emulsie PCR, fragmentul de bibliotecă ADN este inundat secvențial cu fiecare trifosfat nucleozidic (dNTP), ca și în pirosequencing. DNTP este apoi încorporat în noua componentă, dacă este complementar nucleotidei de pe componenta țintă., De fiecare dată când o nucleotidă este adăugată cu succes, un ion de hidrogen este eliberat și detectat de senzorul de pH al secvențiatorului. Ca și în metoda pirosecvenței, dacă se adaugă mai mult de unul din aceleași nucleotide, modificarea pH-ului/intensității semnalului este în mod corespunzător mai mare.

Ion torrent secvențiere este prima comerciale tehnica de a nu folosi fluorescență și camera de scanare; prin urmare, este mai rapid și mai ieftin decât multe dintre celelalte metode., Din păcate, poate fi dificil să enumerăm numărul de baze identice adăugate consecutiv. De exemplu, poate fi dificil să se diferențieze schimbarea pH-ului pentru o homorepeat de lungime 9 la una de lungime 10, ceea ce face dificilă decodarea secvențelor repetitive.

secvențierea prin ligare (SOLiD)

SOLiD este o metodă enzimatică de secvențiere care utilizează ADN ligaza, o enzimă utilizată pe scară largă în biotehnologie pentru capacitatea sa de a lega catenele de ADN dublu catenar (Figura 6)., Emulsia PCR este utilizată pentru a imobiliza / amplifica o regiune de legare a grundului ssDNA (cunoscută sub numele de adaptor) care a fost conjugată cu secvența țintă (adică secvența care urmează să fie secvențiată) pe o perlă. Aceste margele sunt apoi depuse pe o suprafață de sticlă − se poate obține o densitate mare de margele care, la rândul lor, mărește debitul tehnicii.odată ce depunerea șirag de mărgele a avut loc, un primer de lungime N este hibridizat la adaptor, apoi perlele sunt expuse la o bibliotecă de sonde 8-mer care au diferite colorant fluorescent la capătul 5′ și o grupare hidroxil la capătul 3′., Bazele 1 și 2 sunt complementare nucleotidelor care trebuie secvențiate, în timp ce bazele 3-5 sunt degenerate, iar bazele 6-8 Sunt baze inozinice. Numai o sondă complementară va hibridiza la secvența țintă, adiacentă primerului. ADN-ul ligaza este apoi folosește să se alăture sondei 8-mer la primer. O legătură de fosforotioat între bazele 5 și 6 permite ca colorantul fluorescent să fie scindat din fragment folosind ioni de argint., Această scindare permite măsurarea fluorescenței (se folosesc patru coloranți fluorescenți diferiți, toți având spectre de emisie diferite) și generează, de asemenea, o grupare 5′-fosfat care poate suferi o ligare suplimentară. Odată ce prima rundă de secvențiere este finalizată, produsul de extensie este topit și apoi o a doua rundă de secvențiere este realizată cu un grund de lungime N−1. Multe runde de secvențiere folosind grunduri mai scurte de fiecare dată (adică N−2, N−3 etc) și măsurarea fluorescenței asigură secvențierea țintei.,datorită metodei de secvențiere cu două baze (deoarece fiecare bază este secvențiată efectiv de două ori), tehnica solidă este extrem de precisă (la 99.999% cu un al șaselea primer, este cea mai precisă dintre platformele de a doua generație) și, de asemenea, ieftină. Se poate finaliza o singură rulare în 7 zile și în acest timp poate produce 30 Gb de date. Din păcate, principalul său dezavantaj este că lungimile de citire sunt scurte, ceea ce îl face nepotrivit pentru multe aplicații.,

Reversibile terminator de secvențiere (Illuminati)

Reversibile terminator secvențiere diferă de cele tradiționale metoda Sanger în care, în loc de încheiere primer extension ireversibil folosind dideoxynucleotide, modificat de nucleotide sunt utilizate în reversibilă reziliere. În timp ce multe alte tehnici folosesc emulsie PCR pentru a amplifica fragmentele de bibliotecă ADN, terminația reversibilă utilizează bridge PCR, îmbunătățind eficiența acestei etape a procesului.,terminatoarele reversibile pot fi grupate în două categorii: 3′-terminatoare reversibile blocate O și 3′-terminatoare reversibile deblocate.

3′-o-blocat terminatoare reversibile

mecanismul utilizează o secvențiere prin sinteză abordare, alungirea grund într-un mod pas cu pas. În primul rând, grundurile și șabloanele de secvențiere sunt fixate pe un suport solid. Suportul este expus la fiecare dintre cele patru baze ADN, care au un fluorofor diferit atașat (la baza azotată) în plus față de o grupare 3′-o-azidometil (Figura 7).,

Numai de bază corectă anneals la țintă și ulterior este legat la grund. Suportul solid este apoi fotografiat și nucleotidele care nu au fost încorporate sunt spălate și ramura fluorescentă este scindată folosind TCEP (tris(2-carboxietil)fosfină). TCEP elimină, de asemenea, 3′-O-azidomethyl grup, de regenerare 3′-OH, și ciclul poate fi repetat (Figura 8) .,

3′-deblocat reversibile terminatori

reversibile încetarea grup de 3′-deblocat reversibile terminatori este legată atât de bază și fluorescența de grup, care acum acționează ca o parte din rezilierea grup, precum și un reporter. Această metodă diferă de metoda terminatoarelor reversibile blocate 3 ‘-o în trei moduri: în primul rând, poziția 3’nu este blocată (adică., baza are 3’-OH liber); fluoroforul este același pentru toate cele patru baze; și fiecare bază modificată este curgată secvențial, mai degrabă decât în același timp.principalul dezavantaj al acestor tehnici constă în lungimea lor slabă de citire, care poate fi cauzată de unul dintre cele două fenomene. Pentru a preveni încorporarea a două nucleotide într-o singură etapă, un bloc este pus în aplicare, cu toate acestea, în cazul în care nu se adaugă bloc din cauza unei sinteze slabe, firele pot deveni în afara fazei creând zgomot care limitează lungimea citită. Zgomotul poate fi, de asemenea, creat dacă fluoroforul este atașat sau îndepărtat fără succes., Aceste probleme sunt predominante în alte metode de secvențiere și sunt principalii factori limitativi pentru a citi lungimea.

această tehnică a fost pionierat de Illumina, cu platformele lor HiSeq și MiSeq. HiSeq este cel mai ieftin dintre secvențele de a doua generație, cu un cost de 0, 02 USD pe milion de baze. De asemenea, are o ieșire de date ridicată de 600 Gb pe rulare, care durează aproximativ 8 zile pentru a fi finalizată.o nouă cohortă de tehnici a fost dezvoltată de atunci folosind secvențierea unei singure molecule și secvențierea în timp real, eliminând nevoia de amplificare clonală., Acest lucru reduce erorile cauzate de PCR, simplifică pregătirea bibliotecii și, cel mai important, oferă o lungime de citire mult mai mare folosind platforme de transfer mai mari. Exemplele includ platforma Pacific Biosciences care utilizează secvențierea SMRT (single molecula real time) pentru a da lungimi de citire de aproximativ o mie de baze și Helicos Biosciences care utilizează secvențierea unei singure molecule și, prin urmare, nu necesită amplificare înainte de secvențiere. Oxford Nanopore Technologies dezvoltă în prezent nanopori pe bază de siliciu care sunt supuși unui curent care se schimbă pe măsură ce ADN-ul trece prin pori., Se anticipează că aceasta este o metodă rapidă de secvențiere a ADN-ului, deși trebuie abordate mai întâi probleme precum încetinirea transportului prin pori.la fel cum secvențierea generației următoare a permis secvențierea genomică la scară masivă, a devenit clar recent că codul genetic nu conține toate informațiile necesare organismelor. Modificările epigenetice ale bazelor ADN, în special 5-metilcitozina, transmit, de asemenea, informații importante.,toate platformele de secvențiere de a doua generație depind, cum ar fi secvențierea Sanger, de PCR și, prin urmare, nu pot secventa baze ADN modificate. De fapt, atât 5-metilcitozina, cât și 5-hidroximetilcitozina sunt tratate ca citozină de enzimele implicate în PCR; prin urmare, informațiile epigenetice se pierd în timpul secvențierii.,

Bisulfit de secvențiere

Bisulfit de secvențiere exploatează diferența de reactivitate dintre guanină și 5-methylcytosine cu privire la bisulfit: citozina este deaminated de bisulfit de a forma uracil (care spune ca T când esalonate), în timp ce 5-methylcytosine situație implică (de exemplu, prevede C). Dacă două runde de secvențiere se fac în paralel, una cu tratament cu bisulfit și una fără, diferențele dintre ieșirile celor două runde indică citozine metilate în secvența inițială., Această tehnică poate fi utilizată și pentru dsDNA, deoarece după tratamentul cu bisulfit, firele nu mai sunt complementare și pot fi tratate ca ssDNA.

5-Hydroxymethylcytosine, o altă importantă modificare epigenetice, reacționează cu bisulfit de a forma citozină-5-methylsulfonate (care prevede C atunci când ordonate). Acest lucru complică oarecum problemele și înseamnă că secvențierea bisulfitului nu poate fi utilizată ca un adevărat indicator al metilării în sine.,

Oxidativ bisulfit de secvențiere

Oxidativ bisulfit de secvențiere adaugă o substanță chimică de oxidare pas, care convertește 5-hydroxymethylcytosine a 5-formylcytosine folosind potasiu perruthenate, KRuO4, înainte de bisulfit de tratament. 5-Formilcitozina este deformilată și deaminată pentru a forma uracil prin tratament cu bisulfit. Acum, sunt necesare trei serii separate de secvențiere pentru a distinge citozina, 5-metilcitozina și 5-hidroximetilcitozina (vezi Figura 9).,

Aplicații de Next-generation sequencing

Next generation sequencing a permis cercetătorilor de a colecta cantități mari de secvențiere genomică date., Această tehnologie are o multitudine de aplicații, cum ar fi: diagnosticarea și înțelegere boli complexe; întreaga-secventiere a genomului; analiza de modificări epigenetice; mitocondriale secvențiere; transcriptomului secvențiere − înțelegerea modului de modificat expresia de variante genetice afectează un organism; și exome secvențiere − mutații în exome sunt considerate a conține până la 90% din mutații în genomul uman, ceea ce duce la boală., Tehnicile ADN au fost utilizate pentru a identifica și izola genele responsabile de anumite boli și pentru a furniza copia corectă a genei defecte cunoscută sub numele de „terapie genică”.o zonă de focalizare mare în terapia genică este tratamentul cancerului – o metodă potențială ar fi introducerea unui ARN antisens (care împiedică în mod specific sinteza unei proteine vizate) la oncogenă, care este declanșată pentru a forma celule tumorale. O altă metodă se numește „terapie genică suicidară”, care introduce gene pentru a ucide selectiv celulele canceroase., Sunt cunoscute multe coduri genetice pentru proteine și enzime toxice, iar introducerea acestor gene în celulele tumorale ar duce la moartea celulelor. Dificultatea acestei metode este de a asigura un sistem de livrare foarte precis pentru a preveni uciderea celulelor sănătoase.
aceste metode sunt posibile prin secvențiere pentru a analiza genomul tumorii, permițând experților medicali să adapteze mai eficient chimioterapia și alte tratamente pentru cancer la compoziția genetică unică a pacienților lor, revoluționând etapele de diagnostic ale medicinei personalizate.,pe măsură ce costul secvențierii ADN scade, acesta va deveni mai răspândit, ceea ce aduce o serie de probleme. Secvențierea produce volume uriașe de date și există multe provocări computaționale asociate procesării și stocării datelor. Există, de asemenea, probleme etice, cum ar fi proprietatea ADN-ului unui individ atunci când ADN-ul este secvențiat. Datele de secvențiere ADN trebuie să fie stocate în siguranță, deoarece există preocupări că grupurile de asigurări, brokerii ipotecari și angajatorii pot utiliza aceste date pentru a modifica cotațiile de asigurare sau pentru a face distincția între candidați., Secvențierea poate ajuta, de asemenea, pentru a afla dacă un individ are un risc crescut pentru o anumită boală, dar dacă pacientul este informat sau dacă există un leac pentru boala este o altă problemă cu totul.

Ahmadian, A.; Svahn, H.; masiv paralel. Sequencing platforme folosind Lab pe un cip tehnologii. Cip De Laborator, 11, 2653 − 2655 (2011).Balasubramanian, s.; secvențierea acizilor nucleici: de la chimie la medicină. Chem. Comun. 47, 7281 − 7286 (2011).Mardis, E.; metode de secvențiere ADN de generație următoare. Annu. Rev. Genomics Zumzet. Genet. 9, 387 − 402 (2008).

Mardis, E.,; Platforme de secvențiere ADN de generație următoare. Annu. Rev. Anal. Chem. 6, 287-303 (2013).Shendure, J.; Ji, H.; secvențierea ADN de generație următoare. Nat. Biotehnologie. 26, 10 1135-1144 (2008).

Vezi și

cartea noastră online gratuită de acizi nucleici conține informații despre toate aspectele chimiei și biologiei acizilor nucleici.