växttillväxt

frön av tomat CM (Castlemart, vild typ) groddes och odlades i en tillväxtkammare under 18 h av ljus vid 27 °C och 6 h mörk vid 18 °C i hydroponik eller substratkultur. Växter med friska expanderade sanna löv skördades för beredning av GCP (ytterligare fil 1: Fig. S1 och Fig. 1)., De epidermala fragmenten av äkta löv samlades enligt beskrivningen för Metod L eller metod S.

skydda celler vid olika stadier av enzymatisk digestion i metod L (A–C) och metod S (d–l). A-F sju fullt expanderade blad av hydroponiska växter som valts för GCP isolering (ytterligare fil 1: Fig. S1). G-i sju fullt expanderade blad av substratet kultur växter som valts för GCP isolering., J-L fyra fullt expanderade blad av hydroponiska växter (yngre växter jämfört med d–f) väljs för GCP isolering. A, D, h, K Status för GCs efter 1,5, 0,5, 2 och 0,5 h av matsmältningen i enzymlösning 1. B, E status för GCs efter 2 och 1 h av digestion i enzymlösning 2. C, F, i, L status för GCs efter 3,5, 2,5, 4,5 och 1,5 h av matsmältningen i enzymlösning 2. Skala barer indikerar 20 µm

beredning av GCP: metod l

de fullt utökade sanna bladen (vägde ~ 10 g) skördades från hydroponiska tomatplantor., Därefter blandades bladen i 1 min (tre pulser på 20 s) i en mixer (18 000 rpm/min) i 250 ml kallt destillerat vatten. Den blandade bladblandningen hälldes genom ett 74-µm nylonnät för att avlägsna brutna mesofyllceller och sköljdes flera gånger med kallt destillerat vatten tills det mesta av skummet som produceras genom blandning i stor utsträckning hade försvunnit och epidermala fragmenten var ljusgröna. Därefter överfördes de epidermala vävnaderna till en kolv innehållande 50 ml enzymlösning 1 som inkuberades i 1,5 h vid 27 ° C i ett skakande vattenbad i mörkret, med skakhastigheten inställd på 100 rpm., Efter 1,5 h inkubation uppsamlades epidermala fragment på ett 58-µm nylonnät, sköljdes försiktigt med basmedium 2 och överfördes till 50 ml enzymlösning 2 i en kolv. Denna lösning innehållande fragmenten inkuberades sedan vid 25 ° C i ett skakande vattenbad (70 rpm) tills de flesta av GCP släpptes, vanligtvis efter cirka 3,5 h. för att förbättra frisättningen av GCP från epidermala peeling, kolven virvlade försiktigt för hand i några sekunder vid slutet av matsmältningen., Dessutom passerades skalorna i enzymlösningen försiktigt flera gånger genom en pipettor utrustad med en 5-ml spets som skars för att frigöra GCP. Enzymolyseffekten bedömdes under ett mikroskop. Den andra enzymförtunningsblandningen filtrerades genom 37-µm nylonnät. De epidermala vävnaderna på nätet sköljdes med basmedium 2 för att ytterligare frigöra GCP. Enzymlösningen innehållande protoplasterna filtrerades sedan genom ett nylon-nät på 15 µm, och de frigjorda GCP samlades (i 50 ml centrifugrör) genom centrifugering i 6 min vid 300×g., GCP tvättades tre gånger med basic medium 2 för att hålla GCP fria från pelleten av blandade celler och annat skräp. Efter avlägsnande av supernatanten gavs en volym av 5 ml protoplaster, som lagrades vid 4 ° C i mörkret för nästa rening eller för andra experiment.

beredning av GCP: metod s

detta protokoll härleddes från ”metod L”, med en modifiering som involverar sammansättningen av enzymlösning 1. Enzymlösning 1 består av 1,0% (w/v) cellulosa ”Onozuka” RS, 0,01% (w/v) Pektolyas Y-23, 0,1% (w/v) PVP-40, 0,25% (w/v) bovint serumalbumin och 0.,5 mM L-askorbinsyra, upplöst i basmedium 1. Förbättringen i metod s minskade den tid som krävs med 2 h jämfört med Metod L. Den första enzymförtunningen behöver bara 0,5 h, medan den andra enzymförtunningen behöver 2,5 h och 1,5 h (med unga växter Fig. 1).

rening av GCP

för att avlägsna fragment av vaskulär vävnad och föroreningar från GCP utfördes ett ytterligare reningssteg som signifikant förbättrar renheten hos GCP., GCP: s reningsprotokoll var enligt tidigare metoder, med modifieringar anpassade för tomat som beskrivs här. Grundlösning 2 tillsattes till GCP-suspensionen för att ge en slutlig volym på 8 ml. Sex milliliter Histopaque (nr 1077, Sigma-Aldrich) pipettades försiktigt in i botten av ett centrifugrör. GCP var sedan noggrant lager ovanpå Histopaque. Rören centrifugerades i 20 min vid 150×g, varefter GCP samlades in från gränssnittet för de två lösningarna med en Pastöripett och överfördes till ett nytt provrör., GCP späddes med Basisk lösning 2, och sedan centrifugerades rören i 6 min vid 300×g. supernatanten avlägsnades och de isolerade GCP återsuspenderades i 1 ml Basisk lösning 2 och hölls på IS i mörkret tills efterföljande test.

bedömning av protoplastviabilitet

GCP: s viabilitet utvärderades genom fluorescensmätningar med fluoresceindiacetat (FDA). Färghydrolysen observerades efter blandning av GCP med inkubationsblandningen i 5 min. FDA: s operationskoncentration var 0,01% (w/v) upplöst i aceton., Protoplastpreparat visades och avbildades med ett fluorescensmikroskop Zeiss Axio Observer D1 med blå excitation med FITC-filterkombinationen.

beredning av MCP

metoden för att isolera Solanum lycopersicum ändras från den som beskrivs av Romano et al. . Fullt expanderade löv skärs i 0,5 cm2 stycken. Bladbitarna överförs sedan till 30 ml enzymlösning: 5 mM Mes, 0,65 m D-mannitol, 1 mM CaCl2, 0,5% (w: V) Macerozyme R-10 (Yakult, Japan), 1% (w: v) cellulas R-10 (Yakult, Japan), 0,25% (w: V) BSA och 0,1% (w: V) PVP-40, pH 5,5 (KOH)., Digestion utförs vid 25 ° C för 2 h med långsam skakning (40 utflykter per min) i ett vattenbad. Enzymlösningen blir grön efter mild virvlande rörelse, vilket indikerar frisättningen av protoplaster. Digestionstiden beror på de experimentella mål och material som används. Det är inte nödvändigt att släppa alla protoplaster från bladstycken. Lösningen filtreras genom 37 µm nylonnät i ett 50 ml centrifugrör. De kvarhållna bladbitarna sköljs med 20 ml inkubationsmedium (0,65 m D-mannitol, 1 mM CaCl2) och filtratet samlas också upp., De frigjorda MCP: erna samlades genom centrifugering i 5 min vid 100×g. pelleten tvättades tre gånger med 0,65 m D-mannitol innehållande 1 mM CaCl2. Isolerade MCP förvarades på IS i mörkret tills användning.

Semi-kvantitativa omvänd transkription PCR-analyser

Totalt RNA extraherat från GCPs och mesophyll cell protoplasts (Flerchipskretsar) med Arcturus PicoPure RNA-Isolering Kit (Applied Biosystems, Kat nr. 12204-01, USA) enligt tillverkarens protokoll., Total RNA åter transkriberades till cDNA med hjälp av Super-Script first-strand synthesis system (TransGen Biotech) enligt tillverkarens instruktioner. Semikvantitativ RT-PCR utfördes med två gener som uttrycktes specifikt i vaktceller eller mesofyllceller för att bedöma protoplastrenheten. Aktingenen (forward primer, 5′-CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′; reverse primer, 5′-tcaccagtccaacaa TAC-3′) användes som kontroll för RT-PCR-experiment., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

kvantitativa PCR-analyser i realtid (qRT-PCR)

qRT-PCR utfördes med fyra gener som preferentiellt uttrycktes i vaktceller eller avbildades som regulatorer för ABA-svar och visade transkriptinduktion eller förtryck som svar på MeJA i vaktceller. GCP-suspension inkuberades i 1,5 ml mikrofugerör vid rumstemperatur under 10 min och behandlades sedan med 50 µM ± MeJA (slutkoncentration) under 5, 10, 15, 20 min. Efter inkubationen samlades skyddsceller samtidigt, frystes och lagrades vid-80 ° C tills vidare analys., Med tanke på att protoplast inducerar uttrycket av stressrelaterade gener, användes två olika transkriptionshämmare, aktinomycin D (33 mg/l) och cordycepin (100 mg/l), i alla förfaranden för isoleringen, inklusive det första steget av blandning . QRT-PCR-analyserna av tidiga sårresponsgener uttryck med eller utan transkriptionshämmare utfördes.

Totalt RNA isolerades från GCPs, med Arcturus PicoPure RNA-Isolering Kit (Applied Biosystems, Kat nr. 12204-01, USA) enligt tillverkarens protokoll., Alla RNA-prover smältes med Rnasfri DNas för att avlägsna genomiskt DNA. Kvaliteten och koncentrationen av var och en av RNA-proverna bestämdes med Namndrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific). Rna-integriteten kontrollerades också av agarosegelelektrofores. För realtids-PCR, totalt RNA var omvänd transkriberas till cDNA med Super-Script första-sträng syntes system (TransGen Biotech) enligt tillverkarens instruktioner., Det cDNA användes som en mall för att utföra real-time PCR med gen-specifika primers (fil 1: Tabell S1) och SYBR Green Mix (TaKaRa) i en CFX96 TouchTM Real-Time PCR system för upptäckt (Bio-Rad). Aktingen användes som en intern normalisering i prover. Vikförändring i genuttryck beräknades med hjälp av ΔΔCt-värden.

proteinutvinning och SDS-SIDANALYSER

lösliga proteinfraktioner av blad, MCP och GCP bereddes enligt Li och Assmann . Alla efterföljande steg utfördes vid 4 ° C., Protoplaster och lövpulver blandat med 40 µl iskall buffert i mikrofugerör. Bufferten var 50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl2, 2 mM etylendiamintetraättiksyra syra (EDTA), 0,25 mM ethyleneglycoltetraacetic syra (EGTA), 250 mM sackaros, 2 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) och 10 µg ml−1 vardera av de proteashämmare leupeptin, pepstatin och aprotinin. Homogenatet hölls på IS i 20 minuter och centrifugerades sedan vid 10 000×g i 15 minuter och supernatanten användes för 10% SDS-sida. Proteinkoncentrationerna mättes med Brandford Kit.