plantevekst

Frø av tomat CM (Castlemart, wild-type) ble spirer og dyrket i en vekst kammer under 18 h av lys ved 27 °C og 6 h av mørke ved 18 °C i hydroponics eller substrat kultur. Planter med sunn utvidet sanne blader ble høstet for utarbeidelse av GCPs (Ekstra fil 1: Fig. S1 og Fig. 1)., Epidermal fragmenter av ekte blader ble samlet inn som beskrevet for Metoden L eller Metode S.

Guard celler på ulike stadier av enzymatisk fordøyelse i Metoden L (a–c) og Metode S (l–l). a–f Syv fullt utvidet blader av hydroponic planter som er valgt for GCPs isolasjon (Ekstra fil 1: Fig. S1). g–jeg Syv fullt utvidet blader av underlaget kultur planter som er valgt for GCPs isolasjon., j–l Fire fullt utvidet blader av hydroponic planter (yngre planter sammenlignet med d–f) som er valgt for GCPs isolasjon. a, d, h, k status for GCs etter 1,5, 0.5, 2 og 0,5 h av fordøyelsen i fortynnet løsning 1. b, e status for GCs etter 2 og 1 h av fordøyelsen i fortynnet løsning 2. c, f, i, l status for GCs etter 3,5, 2.5, 4.5 og 1.5 h av fordøyelsen i fortynnet løsning 2. Skala linjer indikerer 20 µm

Utarbeidelse av GCPs: Metode L

Det fullt utvidet sanne blader (veide ~ 10 g) ble høstet fra hydroponic tomat planter., Så, bladene var blandet for 1 minutter (tre pulser av 20 s) i en blender (18,000 turtall/min) i 250 ml kaldt destillert vann. Blandet blad blandingen ble strømmet gjennom en 74-mikrometer nylon mesh for å fjerne brutt mesophyll celler og skylles flere ganger med kaldt destillert vann til det meste av skum som produseres ved å blande hadde i stor grad forsvunnet, og epidermal fragmenter ble blek grønn. Så, epidermal vev ble overført til en flaske som inneholder 50 ml fortynnet løsning 1 som ble inkubert i 1,5 t med 27 °C i en risting vannbad i mørket, med risting hastighet satt til 100 rpm., Etter 1,5 timers inkubering, epidermal fragmenter ble samlet inn på en 58-mikrometer nylon mesh, skylles forsiktig med grunnleggende middels 2 og overføres til 50 ml fortynnet løsning 2 i en kolbe. Denne løsningen inneholder fragmenter ble deretter inkubert ved 25 °C i en risting vannbad (70 rpm) før de fleste av de GCPs ble utgitt, vanligvis etter ca 3,5 t. For å forbedre utgivelsen av GCPs fra epidermal peeling, kolbe ble virvlet forsiktig for hånd i et par sekunder på slutten av fordøyelsen., I tillegg skreller i enzymet løsning var forsiktig gått flere ganger gjennom en pipette som er utstyrt med en 5-ml tips som ble kuttet for å slippe GCPs. Den enzymolysis effekten ble vurdert under et mikroskop. Den andre enzym fordøyelsen blandingen ble filtrert gjennom 37-mikrometer nylon mesh. Epidermal vev på mesh ble skylt med grunnleggende middels 2 til ytterligere utslipp GCPs. Enzymet løsning som inneholder protoplasts ble deretter filtrert gjennom en 15-mikrometer nylon mesh, og utgitt GCPs ble samlet inn (i 50-ml sentrifugerør) ved sentrifugering for 6 min på 300×g., Den GCPs ble skylt tre ganger med grunnleggende middels 2 for å holde GCPs gratis fra pellet av blandet celler og annet rusk. Etter fjerning av supernatanten, et volum på 5 ml av protoplasts ble gitt, som ble lagret ved 4 °C i mørket for de neste rensing eller for andre eksperimenter.

Utarbeidelse av GCPs: Metode S

Denne protokollen ble avledet fra «Metoden L», med en endring som involverer sammensetningen av enzymet løsning 1. Enzym løsning 1 består av 1.0% (w/v) cellulose «Onozuka» RS, 0.01% (w/v) Pectolyase Y-23, 0.1% (w/v) PVP-40, 0.25% (w/v) bovine serum albumin og 0.,5 mM L-ascorbic acid, oppløst i grunnleggende medium 1. Forbedringen i Metode S redusert den tiden som kreves av 2 h sammenlignet med Metoden L. første enzymet fordøyelsen trenger bare 0.5 h, mens den andre enzym fordøyelsen behov 2,5 t og 1.5 h (med unge planter Fig. 1).

Rensing av GCPs

for Å fjerne fragmenter av vaskulære vev og forurensning fra GCPs, en ekstra rensing trinn ble utført som vesentlig forbedrer renhet GCPs., Rensing protokoll av GCPs var i henhold til det som tidligere metoder , med endringer som er tilrettelagt for tomat som er beskrevet her. Grunnleggende løsning 2 ble lagt til GCPs suspensjon å gi et endelig volum på 8 ml. Seks milliliter Histopaque (Nr 1077, Sigma-Aldrich) var nøye pipettert i bunnen av en sentrifugerør. Den GCPs var så nøye lag på toppen av Histopaque. Rørene var sentrifugerte for 20 min på 150×g, etter som GCPs ble samlet inn fra grensesnittet av de to løsningene med en Pasteur pipette og overført til en ny test tube., Den GCPs ble fortynnet med grunnleggende løsning 2, og deretter rørene var sentrifugerte for 6 min på 300×g. Supernatanten ble fjernet, og den isolerte GCPs ble resuspendert i 1 ml av grunnleggende løsning 2 og holdt på isen i mørket, før påfølgende tester.

Vurdering av protoplast levedyktighet

levedyktigheten av GCPs ble evaluert ved fluorescens målinger med fluorescein diacetat (FDA). Fargestoff hydrolyse ble observert etter blanding GCPs med inkubasjon blandingen i 5 min. Operativsystemet konsentrasjon av FDA var 0,01% (w/v) oppløst i aceton., Protoplast forberedelser ble sett og fotografert ved hjelp av en Zeiss Axio Observatør D1 fluorescensmikroskop med blå eksitasjon bruke FITC filter kombinasjon.

Utarbeidelse av MCPs

metode for å isolere Solanum lycopersicum er endret fra det som er beskrevet av Romano et al. . Fullt utvidet bladene er kuttet til 0,5 cm2 stykker. Bladet bitene blir så overført til 30 ml fortynnet løsning: 5 mM Mes, 0,65 M D-mannitol, 1 mM CaCl2, 0.5% (w: v) Macerozyme R-10 (Yakult, Japan), 1% (w: v) Cellulase R-10 (Yakult, Japan), 0.25% (w: v) BSA og 0,1% (w: v) PVP-40, pH 5,5 (KOH)., Fordøyelsen er utført ved 25 °C i 2 timer med treg risting (40 utflukter per min) i et vannbad. Enzymet løsning blir grønn når skånsom virvler bevegelse, noe som indikerer utgivelsen av protoplasts. Fordøyelsen tid avhenger av den eksperimentelle mål og materialer. Det er ikke nødvendig å slippe all protoplasts fra blad stykker. Løsningen filtreres gjennom 37 µm nylon mesh i en 50 ml sentrifugerør. Bladet stykker beholdt er skylt med 20 ml av inkubasjon medium (0,65 M D-mannitol, 1 mM CaCl2) og filtratet er også samles., Utgitt MCPs ble samlet inn ved sentrifugering for 5 min på 100×g. Den pellet ble skylt tre ganger med 0,65 M D-mannitol som inneholder 1 mM CaCl2. Isolert MCPs ble lagret på isen i mørket før bruk.

Semi-kvantitative omvendt-transkripsjon PCR-analyser

Total RNA ble ekstrahert fra GCPs og mesophyll celle protoplasts (MCPs) ved hjelp av Arcturus PicoPure RNA Isolert Sett (Applied Biosystems, Kat. 12204-01, USA) i henhold til produsentens protokollen., Total RNA ble omvendt-transkribert til cDNA ved hjelp av Super-Script første-strand system synthesis (TransGen Biotech) i henhold til produsentens instruksjoner. Semi-kvantitativ RT-PCR ble utført med to gener som ble spesielt uttrykt i vakt celler eller mesophyll celler for å vurdere protoplast renhet. Den Actin genet (forward primer, 5′-CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′; revers primer, 5′-TCACCAGAGTCCAACACAA TAC-3′) ble brukt som en kontroll for RT-PCR-eksperimenter., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

Kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR) analyser

qRT-PCR ble utført med fire gener som ble fortrinnsvis uttrykt i vakt celler eller avbildet som regulatorer av ABA svar og viste transkripsjonen nivå induksjon eller undertrykkelse i respons til MeJA i vakt celler. GCPs suspensjon inkubert i 1,5 ml microfuge rør ved romtemperatur i 10 minutter, og deretter behandlet med 50 mikrometer ± MeJA (endelig konsentrasjon) for 5, 10, 15, 20 min. Etter inkubering, vakt celler ble samlet inn samtidig, frosset og lagret ved − 80 °C før videre analyse., Tatt i betraktning at protoplasting induserer uttrykk for stress-forbundet gener, to forskjellige transkripsjon-hemmere, actinomycin D (33 mg/L) og cordycepin (100 mg/L), ble brukt i alle prosedyrer for isolering, inkludert det første trinnet av blending . QRT-PCR analyser av tidlig såret-respons-gener uttrykk med eller uten transkripsjon-hemmere ble utført.

Total RNA ble isolert fra GCPs, ved hjelp av Arcturus PicoPure RNA Isolert Sett (Applied Biosystems, Kat. 12204-01, USA) i henhold til produsentens protokollen., Alle RNA-prøvene ble fordøyd med RNase-fri DNase å fjerne genomisk DNA. Kvalitet og konsentrasjon av hvert av RNA-prøvene ble fastsatt ved hjelp av Namedrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific). Integriteten av RNA ble også sjekket av agarose gel elektroforese. For real-time PCR, total RNA ble omvendt-transkribert til cDNA ved hjelp av Super-Script første-strand system synthesis (TransGen Biotech) i henhold til produsentens instruksjoner., Den cDNA ble brukt som mal for å utføre real-time PCR med gen-spesifikke primere (Ekstra fil 1: Tabell S1) og SYBR Green Mix (TaKaRa) i en CFX96 TouchTM Real-Time PCR detection system (Bio-Rad). Actin genet ble brukt som en intern normalisering i prøvene. Brett endring i genuttrykk ble beregnet ved hjelp av ΔΔCt verdier.

Protein utvinning og SDS-PAGE analyser

Løselig protein fraksjoner av blader, MCPs og GCPs var utarbeidet i henhold til Li og Assmann . Alle etterfølgende trinn ble utført ved 4 °C., Protoplasts og etterlater pulver blandet med 40 µl av is-kaldt buffer i microfuge rør. Bufferen var 50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl2, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0,25 mM ethyleneglycoltetraacetic syre (EGTA), 250 mM sukrose, 2 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) og 10 µg ml−1 hver av proteasehemmere leupeptin, pepstatin og aprotinin. Den homogenate ble holdt på isen for 20 min og så sentrifugerte på 10 000×g i 15 min og supernatanten ble brukt til 10% SDS-PAGE. Protein-konsentrasjonene ble målt ved Brandford Kits.