creșterea Plantelor

Seminte de tomate CM (Castlemart, de tip sălbatic) au fost germinate și cultivate într-o cameră de creștere sub 18 h de lumină la 27 °C si 6 ore de intuneric la 18 °C în seră sau substratul de cultură. Plantele cu frunze sănătoase extinse au fost recoltate pentru prepararea GCP-urilor (fișier suplimentar 1: Fig. S1 și Fig. 1)., Fragmentele epidermice ale frunzelor adevărate au fost colectate conform metodei l sau metodei S.

Garda de celule în diferite etape ale digestia enzimatică în Metoda L (a–c) și Metoda S (d–l). a-f șapte frunze complet extinse ale plantelor hidroponice selectate pentru izolarea GCP-urilor (fișier suplimentar 1: Fig. S1). g-I șapte frunze complet extinse ale plantelor de cultură substrat selectate pentru izolarea GCP-urilor., j-L patru frunze complet extinse ale plantelor hidroponice (plante mai tinere comparativ cu d–f) selectate pentru izolarea GCP-urilor. a, d, h, k starea GCs după 1,5, 0,5, 2 și 0,5 h de digestie în soluția enzimatică 1. B, E starea GCs după 2 și 1 h de digestie în soluția enzimatică 2. C, f, i, L starea GCs după 3,5, 2,5, 4,5 și 1,5 h de digestie în soluția enzimatică 2. Scară bare indică 20 µm

Prepararea de gcp-uri: Metoda L

complet extins frunze adevărate (cântărit ~ 10 g) au fost recoltate de la hidroponice de plante de tomate., Apoi, frunzele au fost amestecate timp de 1 min (trei impulsuri de 20 s) într-un blender (18.000 rpm/min) în 250 ml de apă distilată rece. Amestecul de frunze amestecat a fost turnat printr-o plasă de nailon de 74 µm pentru a îndepărta celulele mezofile rupte și clătit de mai multe ori cu apă distilată rece până când cea mai mare parte a spumei produse prin amestecare a dispărut în mare parte și fragmentele epidermice au fost verde pal. Apoi, țesuturile epidermice au fost transferate într-un balon conținând 50 ml de soluție enzimatică 1 care a fost incubat timp de 1,5 ore la 27 °C într-o baie de apă agitată în întuneric, cu viteza de agitare setată la 100 rpm., După 1,5 ore de incubare, fragmentele epidermice au fost colectate pe o plasă de nailon de 58 µm, clătite ușor cu mediul de bază 2 și transferate în 50 ml de soluție enzimatică 2 într-un balon. Această soluție conținând fragmente fost apoi incubate la 25 °C într-o baie de apă cu agitare (70 rpm) până la cel mai gcp-uri au fost lansate, de obicei, după aproximativ 3,5 h. Pentru a îmbunătăți eliberarea de gcp-uri din epidermică coji, balonul a fost învârtit ușor de mână pentru câteva secunde la final de digestie., În plus, cojile din soluția enzimatică au fost trecute ușor de mai multe ori printr-un pipettor echipat cu un vârf de 5 ml care a fost tăiat pentru a elibera GCP-urile. Efectul enzimolizei a fost evaluat la microscop. Al doilea amestec de digestie enzimatică a fost filtrat prin plasă de nailon de 37 µm. Țesuturile epidermice de pe plasă au fost clătite cu mediu de bază 2 pentru a elibera în continuare GCP-uri. Soluția enzimatică care conține protoplastele a fost apoi filtrată printr-o plasă de nylon de 15 µm, iar GCP-urile eliberate au fost colectate (în tuburi de centrifugă de 50 ml) prin centrifugare timp de 6 min la 300×g., GCP-urile au fost spălate de trei ori cu mediu de bază 2 pentru a menține GCP-urile libere de peletele celulelor mixte și alte resturi. După îndepărtarea supernatantului, a fost obținut un volum de 5 ml de protoplaste, care a fost păstrat la 4 °C în întuneric pentru următoarea purificare sau pentru alte experimente.

prepararea GCPs: metoda s

acest protocol a fost derivat din „metoda L”, cu o modificare care implică compoziția soluției enzimatice 1. Soluția enzimatică 1 constă din 1,0% (g/v) celuloză” Onozuka ” RS, 0,01% (g/v) Pectolyază Y-23, 0,1% (g/v) PVP-40, 0,25% (g/v) albumină serică bovină și 0.,5 mM acid L-ascorbic, dizolvat în mediu bazic 1. Îmbunătățirea metodei S a redus timpul necesar cu 2 h comparativ cu metoda L. prima digestie enzimatică are nevoie doar de 0,5 h, în timp ce a doua digestie enzimatică are nevoie de 2,5 h și 1,5 h (cu plante tinere Fig. 1).pentru a elimina fragmentele de țesut vascular și contaminanți din GCPs, a fost efectuată o etapă suplimentară de purificare care îmbunătățește semnificativ puritatea GCPs., Protocolul de purificare al PCG a fost conform cu cel al metodelor anterioare, cu modificări adaptate pentru tomate descrise aici. Soluția de bază 2 a fost adăugată la suspensia GCPs pentru a obține un volum final de 8 ml. 1077, Sigma-Aldrich) a fost pipetat cu grijă în fundul unui tub de centrifugă. GCP-urile au fost apoi stratificate cu atenție deasupra Histopaque. Tuburile au fost centrifugate timp de 20 min la 150×g, după care GCP-urile au fost colectate din interfața celor două soluții cu o pipetă Pasteur și transferate într-o nouă eprubetă., GCP-urile au fost diluate cu soluția de bază 2, apoi tuburile au fost centrifugate timp de 6 min la 300×g. supernatantul a fost îndepărtat, iar GCP-urile izolate au fost resuspendate în 1 ml de soluție de bază 2 și ținute pe gheață în întuneric până la testele ulterioare.

evaluarea viabilității protoplastelor

viabilitatea GCP-urilor a fost evaluată prin măsurători de fluorescență cu diacetat de fluoresceină (FDA). Hidroliza colorantului a fost observată după amestecarea GCP – urilor cu amestecul de incubație timp de 5 minute. Concentrația operațională a FDA a fost de 0,01% (g/v) dizolvată în acetonă., Preparatele Protoplast au fost vizualizate și imaginate cu ajutorul unui microscop fluorescent Zeiss Axio Observer D1 cu excitație albastră utilizând combinația de filtre FITC.

prepararea MCP

metoda de izolare a Solanum lycopersicum este modificată de cea descrisă de Romano et al. . Frunzele complet extinse sunt tăiate în bucăți de 0,5 cm2. Frunza piesele sunt apoi transferate la 30 ml de soluție enzimatică: 5 mM Mes, 0,65 M D-manitol, 1 mM CaCl2, de 0,5% (w: v) Macerozyme R-10 (Yakult, Japonia), 1% (w: v) Celulazelor R-10 (Yakult, Japonia), de 0,25% (w: v) BSA și 0,1% (w: v) PVP-40, pH 5.5 (KOH)., Digestia se efectuează la 25 °C timp de 2 ore cu agitare lentă (40 excursii pe minut) într-o baie de apă. Soluția enzimatică devine verde după o mișcare ușoară de rotire, indicând eliberarea protoplastelor. Timpul de digestie depinde de obiectivele experimentale și materialele utilizate. Nu este necesar să eliberați toate protoplastele din bucățile de frunze. Soluția este filtrată prin plasă de nailon de 37 µm într-un tub de centrifugă de 50 ml. Bucățile de frunze reținute sunt clătite cu 20 ml de mediu de incubație (0,65 m D-manitol, 1 mM CaCl2) și se colectează și filtratul., MCP-urile eliberate au fost colectate prin centrifugare timp de 5 min la 100×g. peleta a fost spălată de trei ori cu 0,65 M D-manitol conținând 1 mm CaCl2. MCP-urile izolate au fost depozitate pe gheață în întuneric până la utilizare.

Semi-cantitative revers-transcriere analizele PCR

ARN-ul Total a fost extras din gcp-uri și mesophyll celule protoplasts (Mcp) folosind Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (applied Biosystems, Cat. nr. 12204-01, statele UNITE ale americii) în conformitate cu protocolul producătorului., ARN-ul Total a fost transcris invers în ADNc folosind sistemul de sinteză Super-Script de primă linie (TransGen Biotech) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. RT-PCR Semi-cantitativ a fost efectuat cu două gene care au fost exprimate în mod specific în celulele de gardă sau în celulele mezofile pentru a evalua puritatea protoplastelor. Gena actinică (primer forward, 5′-CCTCTCAGTTCCCGTTGAATAG-3′; primer invers, 5′-TCACCAGAGTCCAACACAA TAC-3′) a fost utilizată ca un control pentru experimentele RT-PCR., The KAT1 gene (forward primer, 5′-GGAATCAGTTGCCTCCAAGA -3′; reverse primer, 5′-GCTGTGGTCTCCCACATAAA-3′) is an ABA-repressed gene preferentially expressed in guard cells. The βCAs gene (βCA1, forward primer, 5′- CCTCTTTCTCCCTTAGCTTCATC -3′, reverse primer, 5′-GTGGACCCATCATCA GGAATAG-3′; βCA2, forward primer, 5′- CAGT GCTTGTGGAGGTATCAA-3′, reverse primer, 5′- TACGGAAAGAGGAGGAGAAAGA-3′; βCA3, forward primer, 5′-TTGTTTCCCTCCAGA ACCTTATC -3′, reverse primer, 5′-GCCT TGATACCTCCACAACTAC-3′) coding for β-carbonic anhydrases plays a direct role in photosynthesis of plants .,

Cantitative real-time PCR (qRT-PCR) analize

qRT-PCR a fost realizată cu patru gene care au fost în mod preferențial și-a exprimat în garda de celule sau descris ca autoritățile de reglementare din ABA răspuns și a arătat transcriere nivel de inducție sau de represiune, ca răspuns la MeJA în garda de celule. Suspensia GCPs se incubează în tuburi de microfuge de 1,5 ml la temperatura camerei timp de 10 minute și apoi se tratează cu 50 µM ± MeJA (concentrație finală) timp de 5, 10, 15, 20 min. După incubare, celulele de protecție au fost colectate simultan, înghețate și depozitate la − 80 °C până la o analiză ulterioară., Având în vedere că protoplasting induce expresia de stres asociate gene, diferite de transcriere inhibitori, actinomicină D (33 mg/L) și cordycepin (100 mg/L), au fost utilizate în toate procedurile de izolare, inclusiv primul pas de amestecare . Au fost efectuate analizele qRT-PCR ale expresiei genelor cu răspuns precoce la nivelul plăgii, cu sau fără inhibitori de transcripție.

ARN Total a fost izolat din GCPs, folosind Arcturus PicoPure ARN Isolation Kit (Applied Biosystems, Cat no. 12204-01, USA) conform protocolului producătorului., Toate probele de ARN au fost digerate cu Dnază fără Rnază pentru a elimina ADN-ul genomic. Calitatea și concentrația fiecărei probe de ARN a fost determinată utilizând spectrofotometrul Namedrop 2000 (Thermo Scientific). Integritatea ARN a fost verificată și prin electroforeza în gel de agaroză. Pentru PCR în timp real, ARN-ul total a fost transcris invers în ADNc folosind sistemul de sinteză Super-Script de primă linie (TransGen Biotech) în conformitate cu instrucțiunile producătorului., De adnc a fost folosit ca un șablon pentru a efectua PCR în timp real cu gene-amorse specifice (Suplimentare fișier 1: Tabelul S1) și SYBR Green Mix (TaKaRa) într-un CFX96 TouchTM PCR în Timp Real sistem de detectare (Bio-Rad). Gena actinei a fost utilizată ca normalizare internă în probe. Modificarea expresiei genelor a fost calculată utilizând valorile ΔΔCt.

extracția proteinelor și analizele SDS-PAGE

fracțiunile proteice solubile ale frunzelor, MCP – urilor și GCP-urilor au fost preparate conform Li și Assmann . Toate etapele ulterioare au fost efectuate la 4 °C., Protoplaste și frunze pulbere amestecat cu 40 µl de tampon rece ca gheața în tuburi de microfuge. Buffer-ul a fost de 50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl2, 2 mM acidul etilendiaminotetraacetic (EDTA), 0.25 mM ethyleneglycoltetraacetic acid (EGTA), 250 mM zaharoză, 2 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) și 10 µg ml−1 fiecare dintre inhibitorii de protează leupeptin, pepstatin și aprotinină. Omogenatul a fost păstrat pe gheață timp de 20 min și apoi centrifugat la 10,000×g timp de 15 min, iar supernatantul a fost utilizat pentru 10% SDS-PAGE. Concentrațiile de proteine au fost măsurate prin kiturile Brandford.